郝利娜 王觅柱 陈玉
[摘要] 目的 檢测胃肠道间质瘤（GIST）组织及瘤旁组织中DNA甲基转移酶1（DNMT1）、DNA甲基转移酶3a（DNMT3a）和DNA甲基转移酶3b（DNMT3b）的表达，并研究整体DNA甲基化。
方法 选取包头医学院第二附属医院2017年1月至2020年1月内镜下切除的GIST组织30例及瘤旁组织30例，应用免疫组化和qRT-PCR方法检测GIST组织和瘤旁组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白和mRNA的表达情况;应用亚硫酸氢盐限制性酶切分析技术（COBRA）分析重复序列LINE-1的甲基化水平。
结果 GIST中DNMT1 mRNA的表达与瘤旁组织比较，差异无统计学意义（P>0.05）;GIST中的DNMT3a mRNA表达高于瘤旁组织，差异有统计学意义（P<0.001）;GIST中的DNMT3b mRNA表达高于瘤旁组织，差异有统计学意义（P<0.001）。DNMT1蛋白在GIST及瘤旁组织中的阳性率比较，差异无统计学意义（P=1.000）;DNMT3a蛋白在GIST中的阳性率高于瘤旁组织，差异有统计学意义（P=0.045）;DNMT3b蛋白在GIST中的阳性率高于瘤旁组织，差异有统计学意义（P=0.017）。GIST中LINE-1序列的甲基化水平低于瘤旁组织，差异有统计学意义（P<0.001）;GIST中LINE-1序列的非甲基化水平高于瘤旁组织，差异有统计学意义（P=0.001）。
结论 DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的异常表达与GIST的发生发展有密切关系，具体机制可能与降低整体甲基化水平有关。
[关键词] 胃肠道间质瘤;DNA甲基转移酶;基因表达;免疫组化;甲基化
[中图分类号] R573 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）08-0039-04
Expression and DNA methylation of DNMT1， DNMT3a and DNMT3b in gastrointestinal stromal tumors
HAO Li′na1 WANG Mizhu2 CHEN Yu3
1.Clinical Medicine， Graduate School， Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014040， China; 2.Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Baotou 014030， China; 3.General Practice， Inner Mongolia Baogang Hospital， Baotou 014010， China
[Abstract] Objective To detect the expression of DNA methyltransferase 1（DNMT1）， DNA methyltransferase 3a （DNMT3a） and DNA methyltransferase 3b （DNMT3b） in gastrointestinal stromal tumor （GIST） tissues and adjacent tissues， and to study the overall DNA methylation. Methods A total of 30 cases of GIST and 30 cases of adjacent tissues were collected， all of which were resected under endoscopy in the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College from January 2017 to January 2020. Immunohistochemistry and qRT-PCR methods were used to detect the expression of DNMT1， DNMT3a and DNMT3b proteins and mRNA in GIST and adjacent tissues; combined bisulfite restrition analysis （COBRA） was used to analyze the methylation level of repetitive sequence LINE-1. Results The expression of DNMT1 mRNA in GIST was not different from that of adjacent tissues， and the difference was not statistically significant（P>0.05）. The expression of DNMT3a mRNA in GIST was higher than that in adjacent tissues， and the difference was statistically significant（P<0.001）; the expression of DNMT3b mRNA in GIST was higher than that of adjacent tissues， and the difference was statistically significant （P<0.001）. There was little difference in the positive rate of DNMT1 protein in GIST and adjacent tissues， and the difference was not statistically significant（P=1.000）; the positive rate of DNMT3a protein in GIST was higher than that in adjacent tissues， and the difference was statistically significant（P=0.045）; the positive rate of DNMT3b protein in GIST was higher than that in adjacent tissues， and the difference was statistically significant （P=0.017）. The methylation level of LINE-1 in GIST was lower than that in the adjacent tissue， and the difference was statistically significant （P<0.001）; the non-methylation level of LINE-1 in GIST was higher than that in adjacent tissues， and the difference was statistically significant （P=0.001）. Conclusion The abnormal expression of DNMT1， DNMT3a and DNMT3b is closely related to the occurrence and development of GIST， and the specific mechanism may be related to the reduction of overall methylation level.
[Key words] Gastrointestinal stromal tumor; DNA methyltransferase; Gene expression; Immunohistochemistry; Methylation
胃肠道间质瘤（Gastrointestinal stromal tumors，GIST）在胃肠道肿瘤中最常见，可能来自于Cajal间质细胞（Interstitial cells of cajals，ICCs）或干细胞前体细胞。在GIST中，存在异常甲基化的报道[1]，从消化道上皮增生到形成浸润病灶的过程中，DNA甲基化扮演了重要的角色。DNA甲基转移酶催化并维持DNA的基本结构和功能[2]，到目前为止，有3种DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）被发现[3]，即DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）、DNA甲基转移酶3a（DNA methyltransferase 3a，DNMT3a）和DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferase 3b，DNMT3b），此三者同时调节DNA的甲基化。本研究旨在通过检测DNA甲基转移酶在GIST和瘤旁组织中的表达变化，以及整体DNA的甲基化水平，观察DNA甲基转移酶在GIST发生发展中的作用，以期寻找新的消化道肿瘤生物标志物。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取包头医学院第二附属医院2017年1月至2020年1月内镜下切除的GIST组织30例及瘤旁组织30例，全部病例均经病理确诊。纳入标准：患者未经任何抗肿瘤药物治疗或未接受放化疗治疗;瘤旁组织距离肿瘤切缘>5 cm，且标本未经任何生物化学处理。排除标准：患者曾接受相关治疗;瘤旁组织距离肿瘤太近;标本经过甲醛溶液浸泡。
1.2 方法
1.2.1 试剂 提取RNA试剂盒（北京中山金桥）;反转录试剂盒（北京中山金桥）;鼠抗DNMT1单克隆抗体（工作浓度1∶50）、鼠抗DNMT3a单克隆抗体（工作浓度1∶50）、兔抗DNMT3b多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶100）;DAB显色试剂盒（北京中杉金桥）;限制性内切酶Taq1、Tsp509I（美国Santa Cruz公司）;甲基化试剂盒（美国Santa Cruz公司）。
1.2.2 qRT-PCR法 使用RNA试剂盒从GIST和瘤旁组织中提取RNA，利用反转录试剂盒反转录为cDNA;采用cDNA作为反应的模板，在Real-time PCR仪上进行反应（表1）。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃复性60 s，反应40个循环。所有Real-time PCR数据的Ct值通过内参基因的Ct值进行均一化处理（ΔΔCt=ΔCt-ΔCt β-actin），处理完成后，mRNA的相对平均表达量值以ΔΔCt值（DDvalue）的形式进行计算，即ΔΔCt=2-ΔCt，并以此定量。
1.2.3 免疫组化法 GIST组织标本连续切片贴附于经多聚赖氨酸处理的玻片上，80℃烘烤50 min;光镜下观察切片中DNMTl、DNMT3a和DNMT3b蛋白的表达和分布情况，每张切片选取5个高倍视野（200×）。DNMT1和DNMT3a主要为细胞核阳性表达，DNMT3b主要为局灶性核及胞浆阳性表达，阳性染色均为棕黄色（≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分）。着色评分：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，褐色为3分。
1.2.4 整体DNA甲基化水平 采用DNA提取试剂盒提取GIST组织和瘤旁组织中的DNA，DNA引物序列如下：LINE-1-F：5′-CCGTAAGGGGTTAGGGAGTT TTT-3′;LINE-1-R：5′-RTAAAACCCTCRAACCAAATATAA A-3′，以LINE-1作為引物，通过PCR扩增此序列。利用偏重亚硫酸氢盐限制性酶切分析（Combined bisulfite restrition analysis，COBRA）LINE-1序列代表的整体甲基化水平。PCR产物用10UTaq1、Tsp509I消化。
1.3 统计学方法
应用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，采用t检验;计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 GIST和瘤旁组织中DNMT mRNA的表达
GIST中DNMT1 mRNA的表达水平为（0.139±0.074），瘤旁组织的表达水平为（0.107±0.051），两组比较，差异无统计学意义（t=1.950，P=0.056）。见图1A。GIST中DNMT3a mRNA的表达水平为（0.344±0.165），高于瘤旁组织的（0.147±0.087），差异有统计学意义（t=5.785，P<0.001）。
2.2 GIST和瘤旁组织中DNMT蛋白的表达
DNMT1蛋白在GIST及瘤旁组织中的阳性率分别为13.3%（4/30）及10.0%（3/30），差异无统计学意义（χ2=0.000，P=1.000）;DNMT3a蛋白在GIST及瘤旁组织中的阳性率分别为40.0%（12/30）及16.7%（5/30），差异有统计学意义（χ2=4.022，P=0.045）;DNMT3b蛋白在GISI及瘤旁组织中的阳性率分别为53.3%（16/30）及23.3%（7/30），差异有统计学意义（χ2=5.711，P=0.017）。
2.3 GIST基因组的甲基化水平
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（收稿日期：2020-08-20）
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