刘兴丽 彭西 吴邦元 杨菲 袁施彬
摘 要：本研究选用人工驯养繁殖的1、3、6和9日龄红嘴相思鸟健雏的肝脏为材料，通过HE染色法、甲基绿派洛宁法和普鲁士蓝法进行染色，光镜观察肝脏的组织形态结构及肝组织细胞核酸分布和铁含量变化，电镜观察肝细胞的超微结构变化。结果显示，所有日龄的肝组织内结缔组织均不丰富，肝小叶界限均不明显;随雏鸟日龄的增加，肝细胞索逐渐清晰，造血细胞数量减少，肝细胞的RNA含量降低，肝细胞核仁逐渐变小;1、3和6日龄的红嘴相思鸟肝细胞内无铁颗粒沉积，但9日龄雏鸟肝细胞的胞浆内见有大量呈广泛性分布铁颗粒;随日龄的增加，肝细胞内线粒体、内质网等细胞器日益丰富。结果表明，红嘴相思鸟雏鸟肝脏发育与其他幼龄动物肝脏发育存在一定差异，总体表现为随日龄增长，肝脏结构逐步发育成熟，功能也逐渐增强，在育雏后期表现出明显的铁富集。
关键词：红嘴相思鸟;肝脏;组织学;超微结构
Abstract：Livers of healthy nesting red-billed Leiothrix lutea at the 1st ，3rd ，6th and 9th day of brood birds were used as materials in this study.The liver of L.lutea was stained by HE staining，methylgreen-pyronin，and prussian blue staining methods.The tissue morphology and the changes in the distribution of nucleic acid and iron content of liver cells were observed under optical microscope.Electron microscope was used to observe the changes in ultrastructure of liver cells.The results showed that the connective tissue in liver tissues of all ages was not abundant and the boundaries of liver hepatic lobule were not obvious.With the increase of the age of L.lutea，hepatic cords became clearer，the number of hematopoietic cells decreased，the concentrations of RNA in hepatocytes decreased，and the hepatocyte nucleolus gradually became smaller.There were no Fe particle depositions in the liver cells of L.lutea at 1st，3rd，and 6th days ，but there were a large number of Fe particles in the cytoplasm of the liver cells of L.lutea at 9th days.Organelles such as mitochondria and endoplasmic reticulum in liver cells became abundant with the increasing age.To sum up，there is a certain difference between the liver development of L.lutea and other young animals，and the liver structure gradually became mature and the function gradually increased.During the late brooding period，the liver showed obvious iron richness.
Keywords：Leiothrix lutea; liver; histology; ultrastructure
紅嘴相思鸟（Leiothrix lutea），又称相思鸟、红嘴玉、红嘴鸟等，因嘴呈赤红色而得名，隶属于鸟纲雀形目鹟科画眉亚科相思鸟属[1]。野外红嘴相思鸟主要栖息于海拔1200～2800 m的山地常绿阔叶林，常绿落叶混交林、竹林和林缘疏林灌丛地带，冬季多下到海拔1000 m以下的低山、山脚、平原与河谷地带[2]。该鸟体形小巧玲珑，鸣声婉转悦耳，色彩华丽，是驰名国内外的观赏鸟，每年遭到大量捕捉，至使种群数量受到很大破坏，CITES2007已将其列入附录Ⅱ。因此，人工驯繁红嘴相思鸟是缓解野外捕捉压力的有效途径。在对该鸟繁殖生态[3]、消化道形态[4]，骨骼系统[5]和营养调控[6]等方面进行了研究的基础上发现，雏鸟的发育状况，尤其是肝脏的发育是影响繁殖成效的关键因素。因为肝脏为鸟类体内的最大消化腺，比身体同等大小的哺乳类的肝脏更大[7]，是影响鸟体生长发育、免疫调节、物质和能量代谢的重要器官，具有复杂的生理生化功能[8]。本文旨在通过研究育雏期红嘴相思鸟肝脏发育过程中的组织形态变化和某些特殊化学成分的动态变化，在完善比较组织学研究内容的同时，为雀形目鸟类的进化与适应，系统发育等积累基础资料，并促进红嘴相思鸟移地保护成效。
1 材料与方法
1.1 供试材料
选择人工育雏的1、3、6和9日龄的红嘴相思鸟幼鸟各2只（由西华师范大学人工驯养繁殖实验室提供），颈静脉放血处死后迅速解剖，取肝脏组织分别固定于4%多聚甲醛溶液和2.5%戊二醛（4 ℃）中。
1.2 试验设备和仪器
Leica RM 2235轮转式切片机（德国徕卡）;电热恒温鼓风干燥箱（上海琅玕）;Nikon 3 CCD显微照相系统（日本尼康）;Olympus光学显微镜（日本奥林巴斯）;ULTRACUTE 超薄切片机（奥地利剑桥）;Hitachi H-7650型透射电子显微镜（日本日立）;XPS-Supra能谱仪（英国Kratos）。
1.3 试验方法
1.3.1 红嘴相思鸟雏鸟肝脏的组织学及组织化学观察
采取固定于4%多聚甲醛溶液中的1、3、6和9日龄的红嘴相思鸟肝脏组织，进行常规脱水，透明，石蜡包埋，连续冠状切片（厚度5 μm），用于HE、核酸和铁的染色，Olympus光学显微镜下观察并拍照。
HE染色参照王伯沄[9]在《病理学技术》中描述的HE染色法，即常规脱蜡至水后，入苏木素染液10～15 min，水洗后可用1%盐酸酒精进行分化，再经水洗后用0.5%的氨水溶液进行蓝化，水洗后入伊红染液染色10～15 min，水洗后由低浓度到高浓度的酒精脱水，二甲苯透明后，中性树胶封固。
核酸染色采用甲基绿派洛宁法[10]，即常规脱蜡至水后，蒸馏水稍洗，0.2 mol/L、pH 4.8的醋酸缓冲液稍洗，甲基绿派洛宁染液室温下作用30～60 min，醋酸缓冲液浸洗后用滤纸吸干多余水分，丙酮分化20～30 s，丙酮和二甲苯的等量混合液分化、脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
铁染色采用普鲁士蓝法[11]，即常规脱蜡至水后，入Perl"s液处理，再水洗，入1%中性红复染细胞核约3 min，无水酒精脱水、透明，封片。
1.3.2 红嘴相思鸟雏鸟肝脏的超微结构观察
根据光学显微镜观察结果对相关样品进行电镜观察，方法参考文献[12]。具体为采取固定于4℃的2.5%戊二醛中的3、9日龄的红嘴相思鸟肝脏组织块，1%锇酸固定2 h，然后进行乙醇梯度脱水，环氧树脂812包埋，将取材组织用双面刀片切成细条状后，丙酮脱水，环氧树脂包埋，ULTRACUTE 超薄切片机切片，切片用柠檬酸铅和醋酸双氧铀染色，Hitachi H-7650型透射电子显微镜观察并拍照，XPS-Supra能谱仪对元素进行识别。
2 结果与分析
2.1 红嘴相思鸟雏鸟肝脏的HE染色观察
红嘴相思鸟1、3、6和9日龄雏鸟肝脏的HE染色观察結果分别见图1-A、B、C和D。如图所示，1日龄时少数视野中肝细胞排列成较清楚的肝索形态，肝索由单排或双排肝细胞构成，窦皮细胞和窦状隙清晰。在多数肝索形态不清的区域，肝窦呈狭窄闭锁状态，长梭形的窦皮细胞位于肝细胞之间。在肝小叶的不定区域，见有胞核深蓝染、胞浆较少的造血细胞，呈小团块状或索状;3日龄时肝组织形态与1日龄相近，肝细胞胞体较大，胞浆内见有较多的近圆形小空泡，造血细胞的数量仍较多;6日龄和9日龄的肝细胞组织形态结构相似，肝细胞较1和3日龄的胞体变小，数量增多，肝索多由两排肝细胞构成，沿中央静脉放射状排列，窦状隙较狭窄，呈白色缝隙状，窦壁上可见核呈长梭形的扁平状的内皮细胞。与1日龄和3日龄比较，6日龄和9日龄肝组织中的造血细胞数量显著减少;1、3、6和9日龄的肝组织内结缔组织均不丰富，因此，肝小叶界限均不明显。
2.2 红嘴相思鸟雏鸟肝脏的核酸染色观察
用甲基绿派洛宁法对1，3，6和9日龄红嘴相思鸟雏鸟肝脏核酸染色观察结果分别见图2-A、B、C和D。RNA呈紫红色呈弥散性分布于细胞质中，DNA呈蓝色颗粒状分布于细胞核中。
由图可见，1日龄和3日龄红嘴相思鸟肝细胞的胞质内含有丰富的RNA，随日龄增加，胞质内RNA含量逐渐减少，至9日龄时，胞质内仅见有极少量的RNA;1日龄时，DNA均匀弥散，至9日龄时，核膜附近聚集的DNA增多。多数肝细胞内可见1个较大核仁，少数可见2个核仁，核仁多呈卵圆形，位于靠近核膜的位置。1、3日龄时，肝细胞的核仁较粗大，随日龄的增加，核仁逐渐变小。
肝脏中造血细胞的DNA和RNA含量丰富，胞核呈深蓝色，胞浆呈深紫红色。甲基绿派洛宁法更清晰地显示出，1、3日龄肝组织中造血细胞丰富，随着日龄的增加，造血细胞逐渐减少至几近消失。
2.3 红嘴相思鸟雏鸟肝脏的铁染色观察
普鲁士蓝法将铁颗粒染成蓝色。显微观察发现，1、3和6日龄的红嘴相思鸟肝细胞内无铁颗粒沉积，如图3-A所示;9日龄雏鸟肝细胞的胞浆内见有大量蓝染颗粒状的铁颗粒，呈广泛性分布，如图3-B所示。
2.4 红嘴相思鸟雏鸟肝细胞超微结构的电镜观察
根据普鲁士蓝铁染色观察结果，本研究选用3日龄和9日龄雏鸟肝脏样品进行肝细胞超微结构的电镜观察，3日龄雏鸟肝细胞的超微结构如图4-A和4-B所示，9日龄肝细胞的超微结构如图4-C和4-D所示。由图4-A和4-B可见，肝细胞胞体呈多面形，细胞核呈卵圆形或近卵圆形，核仁明显，位于核中央或近核膜处。细胞质中可见线粒体和内质网，线粒体数量众多，呈圆形、卵圆形或长卵圆形，线粒体嵴排列整齐，单层粗面内质网包绕线粒体的现象多见。胞质中见有较多大小不一的脂质体，呈圆形或椭圆形，电子密度较低，均质或呈轮层状结构，核糖体附着在内质网上或游离在细胞质中;由图4-C和4-D所示，与3日龄比较，可见肝细胞线粒体体积增大，胞质内见有大小不等高电子密度的沉积物，经轮谱分析证实为铁颗粒。
3 结论与讨论
肝脏是动物体内最大的消化腺，且是一个极其重要的物质代谢器官，参与机体多种物质如糖原、胆固醇、胆盐、脂蛋白和血浆蛋白的合成、贮存、代谢和转化过程，同时它还解毒以及参与体内防卫体系，灭活和转化内源性及外源性的有毒物质，吞噬细菌、异物等。因此，肝脏的发育状况在极大程度上影响着动物，尤其是幼龄动物生长发育。
肝脏的实质是由许多肝小叶组成，肝小叶间为被膜或肝门伸进的小叶间结缔组织。已有的研究发现，大多数哺乳动物如人、马、牛、东北虎、梅花鹿、狍、马鹿、银黑狐、裸鼹鼠和花尾胡椒鲷等的肝小叶的结缔组织不发达，肝小叶间界限不明显[13-14];而猪和骆驼同属于哺乳动物，但却具有典型的结缔组织包绕的肝小叶边界，肝小叶之间的界限非常清楚[15]。关于鸟类的肝小叶的研究报道也发现，鸡[16]、虎皮鹦鹉[17]、红腹锦鸡[18]、丹顶鹤[19]等动物的肝小叶的结缔组织不发达，肝小叶间界限不明显;而鸭的肝小叶结缔组织较发达，界限较为清晰可辨。本研究发现，红嘴相思鸟的肝小叶分界不明显，是因为红嘴相思鸟肝小叶间结缔组织不发达。这表明即使同属于鸟纲，其肝小叶之间的结缔组织的多少和肝小叶的明显程度仍存在一定的差异。
多数哺乳动物肝脏的肝细胞呈条索状，沿中央静脉呈放射状排列，而家禽（如鸡、鸭、鹅）的肝细胞均排列成管状[16]。对不同日龄的红嘴相思鸟肝脏结构的显微观察发现，肝索多由两排肝细胞构成，肝索围绕中央静脉呈紧密的放射状排列，随着日龄的增长，肝索逐渐成形，肝细胞胞浆中的脂滴逐渐减少，肝脏中造血细胞的数量逐渐减少，表明随着日龄增长，肝脏结构逐渐发育成熟。已有资料报道，一些野鸟，如红腹锦鸡的肝脏形态结构与红嘴相思鸟的相似[17]，这可能与这些鸟类主要以富含蛋白质的昆虫为食有关。
肝细胞多为单核，但约有25%具有双核。有的细胞核大而沉染，DNA为多倍体。一般认为双核和多倍体肝细胞的功能比較活跃。本研究发现，红嘴相思鸟在1日龄和3日龄时，肝细胞核仁较粗大，随日龄的增加，核仁逐渐变小，但在整个育雏阶段DNA含量均较丰富，表明整个育雏期肝细胞均处于较旺盛的分裂增殖阶段。对新生仔猪肝组织中核酸观察发现，从0日龄至3日龄，肝脏DNA浓度明显下降之后至7日龄又增加[8];霍金富等[20]对香猪出生后肝组织的研究中则显示，10日龄时，肝细胞核内DNA密度较1日龄有所下降，20日龄时较10日龄有所增加。不同动物肝脏DNA的不同变化趋势可能是由种属差异所致。
RNA是蛋白质合成过程中的重要参与者，能反映细胞内蛋白质的代谢状况。本研究发现，随着红嘴相思鸟育雏期日龄的增加，肝细胞胞质内RNA密度有所下降且含量明显减少。表明与育雏后期相比，育雏前期和中期的红嘴相思鸟肝细胞合成蛋白质的能力更旺盛。新生仔猪肝脏RNA浓度在出生后3日龄内迅速上升，而在4～7日龄有微弱的下降趋势[8]。新生小白鼠在出生后第7天RNA颗粒明显多于第1天[21]。这些研究结果与幼龄红嘴相思鸟肝组织中RNA的变化趋势不一致，说明鸟类与哺乳动物在生长发育过程中RNA在代谢方面存在一定的差异性。
肝脏是动物体内铁的重要储存部位，铁在肝脏中以铁蛋白或含铁血黄素形式储存，用于代谢和血红蛋白的形成。本研究发现，1、3和6日龄红嘴相思鸟肝细胞中几乎不见铁的存在，而在9日龄红嘴相思鸟肝细胞内出现铁的广泛性沉积。众所周知，铁缺乏引起动物贫血和生长受阻，在家养动物中，缺铁性贫血多发于仔猪。铁过载引发的健康问题也已受到广泛关注，迄今为止，铁过载现象在数种哺乳动物和鸟类被发现，包括八哥[22]、巨嘴鸟[23]、萨勒斯牛[24]、狐猴[25]、貊[26]、红鹿[27]和犀牛[28]等。本研究中所检测的红嘴相思鸟虽系人工繁育，但其食物以天然饲料和昆虫为主，因此其肝脏铁沉积的原因应与人工饲料中铁含量无关，育雏后期相思鸟肝脏出现铁的广泛性沉积可能是因为野生鸟类为了适应野外低铁食物而形成的吸收铁的活跃机制。
线粒体是细胞的“动力站”，是合成能量的场所，高尔基体、内质网和核糖体是细胞内物质合成和代谢的场所。肝细胞的超微结构观察结果显示，3、9日龄红嘴相思鸟肝细胞内均有丰富的细胞器，其中数量最多的是线粒体，呈板层状，且可见单层粗面内质网包绕线粒体;9日龄肝细胞内的细胞器数量较3日龄多，结构也更加清晰。已有研究表明，细胞内线粒体的形状和数量与细胞种类及生理状况密切相关，耗能多的细胞不但线粒体多，而且线粒体嵴的数量也多。与已有研究相符，3、9日龄红嘴相思鸟的肝细胞胞质内均含有丰富的线粒体，表明肝脏是代谢旺盛、对能量需求很大的器官。与3日龄比较，9日龄肝细胞内线粒体体积增大、数量增多，表明红嘴相思鸟肝细胞的物质代谢功能随日龄增长逐渐增强。
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