程汉
关键词：禽流感;免疫抗体;血凝;血凝抑制试验
1 材料及方法
1.1 实验材料
1.1.1 1%红细胞悬液
采集至少3只SPF公鸡或无禽流感或新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用PH7.2、0.01mol/LPBS液或生理盐水洗涤3次，每次均以1000r/min，洗涤后用PBS或生理盐水配制成体积分数为1%红细胞悬液，4℃保存备用。
1.1.2 诊断液
标准禽流感（H4、H6）病毒抗原、标准禽流感（H4、H6）阳性血清，由农业农村部动物疫病诊断液制备中心提供。
1.1.3 仪器
96孔V型微量反应版，移液器，微量振荡器等。
1.1.4 被检血清样品
来自睢宁县各地相当规模的鸡场的鸡群，每个鸡群随机采取健康鸡血样，翅静脉采血2ml/羽，20℃以下气温24h后大部分血清自动析出，可直接检测，不能自动析出的则进行离心分离血清，当天来不及检测的则将血清分离至4℃保存。
1.2 检测方法及步骤
该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法，用来检测禽血清中的免疫抗体。按照《GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术》采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验，利用血凝素（HA）蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象，用来检测禽血清中的免疫抗体，在进行HI试验之前必须先进行HA试验，以确定HI试验中所用抗原的HA滴度。完成HA试验后，以4个HA单位的抗原进行HI试验，以完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度，抗体效价以㏒2表示。
1.2.1 血凝（HA）试验
（1）在v型微量反应板的1～12孔均加入0.025ml
PBS或者生理盐水。
（2）吸取0.025mL病毒悬液（病毒抗原），加入第1孔，混匀。
（3）从第1孔吸取25ul病毒悬液加入第2孔，混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行倍比稀释至11孔，从第11孔吸取25ul，弃去。
（4）每孔加入25ul的生理盐水。
（5）每孔加入25ul 1﹪鸡红细胞悬液（红细胞悬液充分混匀）。
（6）振荡摇匀，在温室下静置40min后观察结果 。对照红细胞将成明显的纽扣状沉到孔底。
结果判定：将血凝板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌，完全血凝（不流淌）的抗原或者病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位。
1.2.2 血凝抑制（HI）试验
根据血凝试验结果配制4HUA的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HUA的抗原的稀释倍数。
（1）在微量反应板的1～11孔加入25ul、第12孔加入50ul的生理盐水。
（2）吸取25ul血清加入第一孔，充分混匀后吸25ul于第二孔，依次对比稀释至第10孔，弃去25ul。
（3）1～11孔均加入含4HUA混匀的病毒抗原液25ul，温室静置至少30min。
（4）每孔加入25ul1﹪红细胞悬液，轻轻混匀，室温静置40min。
结果判定：将血凝板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。以完全抑制4个HAU的血清最高稀释倍数作为HI滴数。
2 统计
根据血凝试验和血凝抑制试验来如实统计各乡镇的鸡群禽流感免疫抗体合格率。（各镇血清样本数量是20，各镇合格率达到90%以上即为合格）
H6总体合格率为91.77%
3 大规模免疫抗体监测在防疫中思考与讨论
近几年来，随着养殖业的不断发展，畜禽饲养量日益增加，集约化、规模化養殖场层出不穷，有的村组几乎每个农户家中都养鸡，鸡舍一幢挨着一幢，且鸡群的批次多、品种不一、鸡群的免疫时间不同等因素，一旦发生疫情，将会产生“多米诺骨牌”效应，损失惨重，甚至血本无归。因此为防止疫情的发生，避免损失，最重要的是做好免疫工作，并确保免疫鸡群的抗体在免疫保护范围内，同时做好生物安全管理工作。但在实际生产中，养殖从业人员素质参差不齐，养殖数量多、批次多、疫苗种类繁多、免疫程序混乱，导致免疫工作存在诸多问题，如应免未免、免疫接种的途径错误、免疫剂量较少（拔针速度过快）、超量频繁免疫造成免疫麻痹等等，其最终的结果就是免疫失败，免疫后的抗体没有达到应有的保护水平。而如何判断鸡群的抗体水平是否达到保护鸡群且不发生疫病，抗体监测是唯一最直接、最有效的手段。
3.1 抗体监测能及时了解鸡群免疫后的免疫效果
当疫苗接种到动物体内后，经过一系列复杂的反应之后才能够产生保护，而这种保护力的产生往往又容易受到多种因素的影响，如疫苗方面、动物方面、接种方式方法及时机选择、饲养管理以及环境等，每一个方面出现变化都有可能对免疫效果产生或多或少的影响。加之动物体的免疫应答过程是以一种人们肉眼看不到、摸不着的方式进行的，因此在对动物接种疫苗之后，究竟体内的免疫应答情况如何，产生的保护情况怎样，虽然涉及的方面很多，但起决定作用的还是针对该接种抗原所产生的抗体，抗体滴度或效价的高低直接影响着免疫效果，因此对鸡群及时采血检测抗体上升情况，从监测即时抗体水平或抗体水平的动态变化，来判断鸡群接种疫苗的免疫效果能否抵抗与疫苗相对应的疫病，免疫完成后只有通过抗体检测免疫效果，才能有效控制疾病的发生。
3.2 定期进行抗体监测，可以根据抗体滴度的高低及时进行免疫
体内抗体水平会随着免疫时间的延长逐渐下降到保护值以下，定期检测鸡群的抗体水平，根据抗体滴度的高低确定加强免疫的时间。系统的监测可更多地掌握各类疫病的抗体变化规律，及时做好免疫工作和时间安排，确保鸡群抗体始终处于免疫保护水平以上，方能发挥最佳的生产性能。
3.3 根据抗体监测的结果，制定和调整鸡群的免疫程序
免疫程序受母源抗体和自身抗体水平、免疫时间、免疫方法、疫苗种类、免疫次数和当地疫病流行情况等因素的影响。良好免疫效果的获得依赖于首次免疫和再次免疫时机是否合适，母源抗体水平决定首次免疫的时间，再次免疫时体内的残留抗体水平决定再次免疫的时间。由于各方面的影响，一个养殖场的免疫程序今年、明年适合，后年可能就不太适合，须随时加以调整修订。一些场照搬其他场免疫程序，或连年不变的做法难免有时免疫失误而引发疫病的流行。因此，不能机械地仿效其他场的免疫程序，而应根据当地疫情情况结合上一代次的免疫情况，以所测的实际抗体水平为依据，制定适合本场的免疫程序，并随时监测、及时修订。
3.4 抗体监测可提示某些疾病发生的风险
如新城疫、禽流感抗体超过13log2，鸡群有可能感染了病毒;低于4log2则不足以抵抗病毒的侵袭。采血检测发病前后鸡群的抗体水平，刚发病时新城疫或禽流感抗体水平低，大部分鸡抗体水平在保护值以下，离散度在5个以上。病情恢复时的抗体上升3～5个滴度以上，且高于免疫所产生的抗体，提示该鸡群可能发生了新城疫或禽流感。
总之，动物疫病监测是动物疫病防治工作中最重要的技术手段，是预防、控制直至根除动物疫病的基础性工作。只有通过长期、连续、可靠地监测，才能及时准确地掌握动物疫病的发生和流行趋势，制定并实施国家动物疫病预防、控制措施，界定动物疫情的发生范围、数量和疫源等疫情信息。
3.5 通过调查免疫抗体不合格的禽群分析原因
主要是养殖户侥幸，怕麻烦，隐瞒未防疫的真相，二是未按照程序。三是免疫方法不当，用苗剂量不足。通过这次大规模的免疫抗体检测，找出我县禽流感免疫工作中存在的问题和不足。针对存在问题，我们对免疫不合格的禽群逐户监督进行补免。
3.6 引起抗体效价不同的原因
家禽机体免疫系统是产生免疫应答的物质基础，由免疫器官、免疫细胞组成。用疫苗对家禽进行免疫接种，刺激机体免疫系统发生应答反应，产生特异免疫力。机体受到抗原物质（疫苗）刺激后，由免疫器官、免疫细胞产生的能与相应抗原特异性结合反应的免疫球蛋白即抗体，具有各种免疫功能，主要存在于机体的血液、淋巴液、组织液中，并以血液中抗体存在最高，血清抗体即循环抗体是主要免疫力。根据抗体产生的动力学，动物机体初次和再次接触抗原后，引起体内产生抗体的水平有较大差异，机体初次接触抗原，在一定时期内体内抗体产生很少，抗体水平维持时间也较短。免疫还具有记忆功能，动物机体在初次接触抗原物质时，除刺激机体形成产生抗体外，也形成了免疫记忆细胞，对再次接触的相同抗原物质可产生更快的免疫应答，当动物机体第二次接触相同的抗原时体内产生的抗体，含量高，而且维持时间长。因此，在对肉鸡进行初次免疫后由于免疫系统是初次应答，加上母源抗体的干扰，因而血清抗体产生慢，数量少，抗体效价普遍较低;而蛋鸡由于在首次免疫禽流感疫苗后，机体对该种疫苗已具有免疫记忆，当再次用此种疫苗进行加强免疫时，机体可迅速产生比上次免疫时更多的抗体，抗体效价普遍较高。同时，禽流感疫苗属油乳剂灭活疫苗，灭活疫苗不同于活疫苗，灭活疫苗特性是接种后不能在动物体内繁殖，使用安全，但灭活苗接种剂量较大，免疫期相对短，并需要重复接种。
通过对养殖户禽流感免疫抗体的全面监测，使每个养禽户对自己禽群的实际免疫效果有一个真正地了解，大多数免疫不合格的养禽户能认真分析免疫工作中存在的问题，更加坚信科学免疫，按程序免疫的决心。对少数抱有侥幸心理，不按规定免疫的抗体不达标的养禽户在监督补免后15～20d再次进行抗体监测;对个别拒防疫用户，通过动物卫生监督机构介入，实行强制免疫，同时乡镇兽醫站与拒防户签订免疫责任状，真正使高致病性禽流感免疫工作实行强制化。全面进行禽流感抗体免疫检测，需要花费大量的人力，物力，单靠市兽医卫生监督所很难做到，我们的做法是在每个乡镇培训2～3名能力强的防疫员负责血样工作。
参考文献
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