蒋向辉 肖龙骞 杨永平
摘要： 黄褐毛忍冬具有消炎、抗菌、免疫调节等多种功效，但容易与忍冬属其他物种混淆，通过生药学研究将为黄褐毛忍冬的鉴定工作和药材标准的制定提供科学依据。该文采用植物学鉴定、显微镜观察、薄层色谱鉴定和分子鉴定的方法从植物学性状、药材显微特征、薄层色谱和ITS（internal transcribed spacer）序列特征等方面对黄褐毛忍冬进行了专属性特征鉴定。结果表明：（1）黄褐毛忍冬花朵横切面分泌细胞较多，花瓣外表面有黄褐色腺毛;花冠表皮上层细胞为多角形，蚌形花粉囊对开，花粉粒形状规则，有三角形和卵圆形两种，油室椭圆形。（2）粉末显微检测发现中柱鞘纤维呈短棱形;木栓细胞棱角明顯，呈浅黄色;木纤维呈粗短的棱形，偶见有弯曲;网纹导管较多，细胞腔密布草酸钙方晶。（3）薄层色谱显示黄褐毛忍冬花中三柰酚含量较高，三柰酚可作为黄褐毛忍冬的检视成分。（4）基于ITS序列系统聚类结果显示，ITS序列可以作为DNA条形码将黄褐毛忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬和金银花准确地区分。上述结果表明黄褐毛忍冬生药学特征明显，该研究为黄褐毛忍冬药材鉴定、成分分析和质量标准制定提供了参考。
关键词：
黄褐毛忍冬， 显微特征， 薄层色谱（TLC）鉴定， ITS序列聚类分析， 生药学研究
中图分类号： Q946; R282.71文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2022）05-0738-07
Pharmacognostic identification study
of Lonicera fulvotomentosa
JIANG Xianghui XIAO Longqian YANG Yongping
Abstract： Lonicera fulvotomentosa has many functions including antiinflammatory， antibacterial， immune regulation， etc.， but it is easily confused with other species of Lonicera. The pharmacognostic research of L. fulvotomentosa will provide a scientific basis for its identification and the formulation of medicinal materials standards. This study combined botanical identification， microscopic observation， thin layer chromatography （TLC） identification， and molecular identification to identify specific characteristics of L. fulvotomentosa， from the aspects of botanical traits， microscopic characteristics of medicinal materials， TLC and ITS sequence feature. The results are as follows：
（1） There are many secretory cells on the crosssection of the flower， many yellowbrown glandular hairs are on the surface of the bract has， the upper layer cell of corolla epidermis is polygonal， the pollen sac is musselshaped， the pollen grains are triangular or oval， and the oil chamber is oval. （2）The results of powder microscopy show that the middle column sheath fibers are short prisms; The cork cells are sharply angular and light yellow; The wood fibers are stubby and prismatic， a few of which are bent; There are many reticulated catheters， and the calcium oxalate square crystals are densely packed in the cell cavity. （3） TLC shows that the content of kaempferol in the flower of L. fulvotomentosa is higher， and kaempferol can be used as the identification component of L. fulvotomentosa. （4） The cluster analysis results based on ITS sequences show that the ITS sequence can be used as the DNA barcode to distinguish L. fulvotomentosa， L. macranthoides， L. confusa and L. japonica. This study provides a theoretical reference for the identification， component analysis， and quality standard formulation of L. fulvotomentosa.032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739
Key words：
Lonicera fulvotomentosa， microscopic features， thin layer chromatography （TLC） identification， ITS sequence cluster analysis， pharmacognostic study
黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa）为忍冬科忍冬属藤本植物，主要分布在我国云南、贵州和广西等省（区）（国家中医药管理局中华本草编委会， 1998），其营养成分及化学组成与忍冬（L. japonica）相似（Wu et al.， 2015），黃褐毛忍冬常被作为忍冬的替代品使用，在预防和治疗流感、SARS、冠状病毒等方面有较好的疗效（He et al.， 2017; Wang et al.， 2019）。已有研究表明，忍冬属药用植物初开的花或花蕾中含有酚酸、类黄酮、三萜皂苷和生物碱等多种活性成分（Shang et al.， 2011），忍冬中咖啡酰奎尼酸衍生物有抗肿瘤活性和抗艾滋病病毒（HIV）活性（Mishima et al.， 2005），Han等（2014）研究也认为忍冬属药用植物活性成分在人类疑难杂症与流行性疾病的治疗和预防中有极好的开发利用前景。
黄褐毛忍冬和金银花（L. japonica）虽然同为忍冬属药用植物，但因其化学成分差异明显，故我国2015版药典对黄褐毛忍冬和金银花主要成分含量的标准并不相同（中华人民共和国国家药典委员会， 2015）。我国中医习惯将黄褐毛忍冬当作金银花的替代品使用，为了避免黄褐毛忍冬和金银花混用产生不良后果，有必要建立准确的鉴定与分析方法。虽然已有学者从形态学鉴定、显微鉴定、光谱鉴定、理化鉴定和生物技术鉴定等方面进行过灰毡毛忍冬与金银花的比较研究（Zhang et al.， 2019），但由于忍冬属植物的花蕾中都含有丰富的酚酸、类黄酮、三萜类皂苷等化合物（Shang et al.， 2011），营养成分与化学组成都极为相似，仅从成分方面将黄褐毛忍冬与金银花分开难度较大。目前，关于黄褐毛忍冬的生药鉴定有过一些报道，但不够详尽，不方便实际鉴定工作。为了更好地对黄褐毛忍冬进行质量控制，确保其药效以及临床应用，有必要对黄褐毛忍冬进行全面的生药学特征鉴别研究，建立多种方法与技术联合的鉴定分析技术，为黄褐毛忍冬药材鉴定、成分分析和质量标准制定提供依据。
1材料与方法
1.1 材料、仪器和试剂
样品来自贵州省兴义则戎镇，经湖南省林业科学研究院王旭军研究员鉴定为忍冬科忍冬属植物黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa）的花及花蕾。标本存放于怀化学院生物与食品工程学院标本室。
仪器：COSUAI型粉碎机（湖南基德电器公司）;科隆101型恒温干燥箱（怀化科仪公司）;BSM型电子天平（上海精平仪器公司）;HH1型恒温水浴锅（长沙科仪公司）;VILBER INFINITY 3026凝胶成像仪（上海制承仪器公司）;YH/TDL5000bR冷冻离心机（四川致研科技有限公司）;1010电热恒温鼓风干燥箱（上海姚氏仪器设备厂）;API258轮转式石蜡切片机（杭州艾普设备有限公司）;XSP201B生物显微镜（上海谱骞光学仪器有限公司）;3PrimeX基因扩增仪（英国Techne公司）。试剂：碘、碘化钾、番红、甲醛、醋酸、苏木精染液、石蜡、甘油、PCR试剂（TAQ酶、dNTP）、TBE缓冲液。
1.2 方法
1.2.1 性状鉴别观察黄褐毛忍冬的茎、叶和花形态特征及新鲜药材的颜色、形状、大小、质地、断裂等特征。
1.2.2 显微鉴别参照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验方法，采集新鲜黄褐毛忍冬的花及花蕾放于安瓿瓶，加入适量的苏木精染液，放于40 ℃温箱中24～36 h，冲净后用稀氨水（1%～2%）浸泡15 min，洗净后依次用35%、55%、75%和95%酒精脱水，在二甲苯浸泡4～6 min后石蜡包埋过夜。用刀片将包埋好的样品进行修块，用酒精灯将其粘贴在小木块上，切片，明胶固定，吸水纸吸去一侧水，放于烘片机上烤干，待其干后，用生物显微镜观察，放于40 ℃恒温箱中烘烤10 d以上，脱蜡，95%酒精配制的番红染液复染，洗脱后封片再观察。
1.2.3 薄层色谱鉴别参照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验方法，分别将黄褐毛忍冬花、幼叶和幼茎粉碎，过40目筛，各称取粉末1.0 g，分别加入20 mL 50%乙醇溶液，水浴回流加热30 min后，置冰水中冷却，抽滤后取滤液，滤液于蒸发皿上挥发至干燥，向残留物中加入4 mL甲醇，将残留物溶于甲醇备用。另以甲醇作为溶剂，制备0.50 mg·mL1的山柰酚对照品溶液。将上述溶液点于同一硅胶G薄层板，采用酸乙酯∶甲酸∶水（8∶1∶1）作为展开剂，于25 ℃和65%温湿度条件下展开，喷10%的硫酸乙醇，干燥后置365 nm的紫外灯下检视。
1.2.4 分子鉴别参照蒋向辉等（2010）采用改良CTAB法分别提取黄褐毛忍冬幼叶、老叶和花的总DNA提取并设计引物，引物序列ITS～F：GGAAGGTAAAAGTCAAGG;ITS～R：TCCTCCGCTT
ATTGATATGC。参照蒋向辉等（2010）的PCR扩增程序进行PCR扩增，DNA片段回收并克隆到pMD 18T载体，挑选6个阳性克隆提取质粒测序，同时对PCR产物直接测序。从NCBI（National Center for Biotechnology Information ）数据库下载包含完整的ITS1（internal transcribed spacer 1）和ITS2（internal transcribed spacer 2）的忍冬属物种ITS序列，采用MEGA X软件对测得序列与NCBI上登录的忍冬属物种ITS序列采用非加权组平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means， UPGMA）构建系统进化树。032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739
2结果与分析
2.1 性状鉴别
黄褐毛忍冬为多年生攀援植物，茎和分枝上有黄褐色柔毛，幼枝上偶见有橘红色腺毛，幼芽鳞片通常为4 对。不同生长时期叶形由针叶到椭圆变化，叶色由黄褐色逐渐变为绿色。成熟叶长为4.0～7.0 cm，宽为1.5～3.0 cm，叶柄长为4.0～7.0 cm，叶柄密布黄褐色腺毛，较硬，叶片为狭长椭圆形，叶片上下表面均被黄褐色腺毛，叶脉网状分布，中脉处腺毛明显可见。茎顶端叶间距1.0～1.5 cm，下部间距较宽，可达6.0 cm。短总状花序着生于叶腋或幼枝顶部。小苞片为长钻形，长为4.0～7.0 mm，小苞片上密布硬而短的腺毛。卵状椭圆形萼筒长1.0～3.0 mm，萼筒上无毛，萼齿较萼筒长。花朵前期白色，后期变为黄色。开放的花朵长3.0～5.0 cm，花筒较唇瓣短，外被黄褐色短腺毛，花丝和花柱较长，雄蕊和柱头外露，表面光滑无毛，柱头为短椭圆形。节间较短，节间花束常为10～22 束，开花较整齐。花期较短，仅2周左右。浆果球状黑色。
2.2 花横切面显微鉴别
黄褐毛忍冬花冠表皮细胞垂周壁链珠状增厚，外平周壁可见波浪状条纹。花粉囊饱满，呈长蚌状，左右对开，直径310.0～370.0 μm。花瓣表皮细胞狭长，排列紧密，细胞壁呈长条状增厚。垂周壁中有多数草酸钙簇晶，棱角较为尖锐。花瓣薄壁细胞近圆形，直径4.0～12.0 μm。花粉粒微黄色，呈长三角形或长卵圆形，直径为5.0～15.0 μm。花粉粒可见有较明显的萌发孔沟。油室呈短椭圆形，切面分泌细胞较多，附近可见有黄棕色分泌物和单细胞非腺毛。具体见图1。
2.3 花粉末显微特征
花粉粉碎后呈黄色，单细胞球形，偶见有淡黄绿色（图2）。中柱鞘纤维呈短棱形，细胞直径19.0～47.0 μm，细胞壁较薄，厚度仅为2.0～7.0 μm。木栓细胞棱角明显，呈浅黄色，数目较多。木纤维呈粗短的棱形，偶见有弯曲，成束或散在分布，细胞直径5.0～52.0 μm，细胞壁厚2.0～14.0 μm，细胞壁纹孔明显，呈斜裂状。木化薄壁细胞淀粉粒复粒较多。具缘纹孔及网纹导管较多，直径约25.0～50.0 μm。含晶细胞壁木质化增厚较为明显，细胞腔内草酸钙方晶较多。树脂道散布有黄棕色分泌物，半透明状。
2.4 薄层色谱鉴别
将黄褐毛忍冬、华南忍冬、金银花和灰毡毛忍冬的花提取物与三柰酚点于同一薄层G板上，置365 nm紫外灯下检视。由图3 可知， 三柰酚与忍a. 子房纵切面; b. 花冠内表皮; c. 花冠外表皮; d. 花丝细胞中簇晶; e. 花粉粒; f. 油室。
冬属四个物种的花提取物在相同位置都发出强的浅蓝色荧光，其中金银花与灰毡毛忍冬能检视到四条谱带，华南忍冬可检视到三条谱带，而黄褐毛忍冬仅能检视到两条谱带，且黄褐毛忍冬在三柰酚处的谱带比其他三个物种更为清晰。结果表明，黄褐毛忍冬花中三柰酚含量较高，通过检视三柰酚薄层色谱谱带特征，可以将黄褐毛忍冬与华南忍冬、金银花和灰毡毛忍冬区分开。
2.5 分子鉴别
由图4可知，分别以黄褐毛忍冬幼叶、老叶和花的基因组DNA为模板可得到同样大小的条带（图4），长度为615 bp。将测序获得的ITS序列拼接校验后，放入NCBI数据库进行BLAST比对确认，从NCBI下载包含完整ITS1和ITS2，且长度在600～620 bp之间的忍冬属17份种质ITS序列，采用UPGMA法将黄褐毛忍冬与忍冬属其他17份种质构建系统发育树。由图5可知，17个物种大致分为两大组：山银花（灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、华南忍冬）和金银花可以聚为一组，这一组为忍冬属药用物种;另一组为忍冬属其他物种，两组的自展支持率均为100%，表明以ITS序列为参考将17个物种划分两组的可信度较高。从图5还可以看出，黄褐毛忍冬与灰毡毛忍冬、华南忍冬亲缘关系较近，本研究为这3个物种同属于山银花这一大类提供了依据。同时结果表明，ITS序列可以作为DNA条形码将黄褐毛忍冬与灰毡毛忍冬、华南忍冬和金银花区分开。
3讨论与结论
近年来，我国中医在中药材的使用过程中对特定的药用物种或品种及其化学成分的选择性并未给予太多重视，中药材被当作一种天然化学混合物使用，通常粗略地认为同属的几个药用物种可以相互替代。然而，具有不同化学成分的同属药材可能表现出不同的药理作用，并且不同成分之间可能发生协同或拮抗作用（Sajeli et al.， 2015），容易导致中药在疗效上产生较大的差异。鉴定中药材的植物来源是我国中药使用中急需关注的问题。中药材活性成分较多且影响其含量变化的因素复杂，这是影响中药材质量鉴定和评价的一大瓶颈，必须建立针对不同药材具有独特性和专一性的检测分析技术和质量标准。近年来，不断完善的薄层色谱技术已经成为天然产物化学成分鉴定与分析中一种相对便宜且易于使用的工具（gnes et al.， 2018），特别是近年来发展起来的高效薄层层析法（HPTLC）简单快捷，能同时检测多个成分，该技术对于槲皮素和山柰酚等黄酮类成分的检测极为灵敏（Hiteksha et al.， 2017）。薄层色谱技术在药材检测中推广和应用的前提是首先必须要找到每种药材独特和专一性的指标成分，对药材进行生药学研究是获得药材独特性和专一性成分的基本途径。
忍冬属药用植物在治疗外源性风热、流行性发热疾病、疮疥等传染病方面有特效（Han et al.， 2014），其抗菌、抗炎、抗氧化等成分与其独特的药理活性紧密相关（Yu et al.， 2019）。忍冬属植物是一个药用物种较多的种属，包括2亚属4组14亚组200种。中国药典中收载的忍冬属五种植物在花蕾形态上相似，极容易混淆，由于化学成分不尽相同，因此临床用法用量也是各有特色（Chu et al.， 2011）。自2015版药典出版以来，山银花（灰毡毛忍冬、华南忍冬、黄褐毛忍冬和红腺忍冬）被视为是金银花（忍冬）常见掺假品，而在实践中，由于我国中医或民族民间医生使用习惯与方法的差异，所以不同医生在治疗不同疾病的过程中使用的品种各不相同。采用多种技术联用对忍冬属药用植物进行全面生药学鉴定对于提高相关药材的疗效有重要的指导作用。本研究结合常规植物学性状鉴别、显微观察、薄层色谱鉴定和分子鉴别从微观到宏观对黄褐毛忍冬进行了全面的生药学鉴定。杨培等（2007）通过粉末显微检测，找到了黄褐毛忍冬花蕾薄壁和厚壁两种不同类型的非腺毛，本研究在此基础上检测到黄褐毛忍冬粉末中带有黄棕色分泌物的分泌细胞，这些分泌细胞可能与黄褐毛忍冬药材颜色有关;通过薄层色谱检测发现黔产灰毡毛忍冬和黄褐毛忍冬与绿原酸对照品在相同的位置上虽然有相同颜色的荧光斑点，但斑点数目与大小基本一致，不适合用于忍冬屬不同物种的鉴别。本研究结果表明三柰酚在黄褐毛忍冬中谱带清晰，含量较高，而在华南忍冬、金银花和灰毡毛忍冬中除三柰酚外还发现有两个以上其他斑点，具体成分有待鉴定。因此认为，三柰酚可以作为黄褐毛忍冬薄层色谱检测的一个重要的指标，该化合物为有别于金银花特征性成分绿原酸与木犀草素的黄酮类化合物。032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739
隨着后基因组时代的来临，忍冬属药用物种基因组学大数据的获得更容易实现，基于分子系统学和基因组学研究有望为揭示黄褐毛忍冬这一道地药材的品质形成机制提供可能。DNA条形码能真实反映物种进化关系，在物种鉴别中有很大的推广应用前景（Gao et al.， 2017）。我国传统中药是药材提取物或是干燥的原药材，DNA提取较为困难，且PCR产物较短，扩增产物序列越短越容易扩增（Sarkinen et al.， 2012）。核糖体DNA的ITS2序列长度通常为260 bp左右，研究表明这是一个较好的DNA条码区域，其具有较高的种间差异和种内保守性（Han et al.， 2013）。Han等（2013）使用ITS2从忍冬属植物中鉴定金银花，但其扩展得到的ITS2比预期要短，并且我国中药大多是复方，涉及多种药材，仅凭一对ITS2通用引物对于数十种草药的鉴别效果并不理想，这对商业用途构成了很大的障碍。本研究以新鲜的黄褐毛忍冬叶和花为材料获得了ITS序列，其长度为615 bp，从NCBI数据库获得的ITS序列长度，金银花为617 bp，华南忍冬为613 bp，灰毡毛忍冬为613或610 bp。聚类分析结果显示，在忍冬属药用物种中，黄褐毛忍冬与灰毡毛忍冬、华南忍冬亲缘可归为一大类，而金银花归为另一类。本研究结果表明基于ITS序列研究忍冬属药用植物的遗传和进化机制有助于忍冬属植物的分类与鉴别，ITS序列可以作为DNA条形码将黄褐毛忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬和金银花忍冬属四个物种进行区分。
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（责任编辑周翠鸣）
收稿日期： 2021-01-08
基金项目： 湖南省教育厅重点资助项目（19A390）;湖南省教育厅创新平台项目（16K069）;贵州省科技厅社会发展项目（黔科合支撑 [2018]2823） [Supported by Key Project Fund of Hunan Provincial Department of Education （19A390）; Innovation Platform Project of Hunan Provincial Department of Education （16K069）; Social Development Project of Guizhou Provincial Department of Science and Technology （Qiankehe Support [2018]2823）]。
第一作者：
蒋向辉（1974-），博士，副教授，主要从事药用植物鉴定与成分分析研究，jxfei789@163.com。032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739
