许刚 何纯青 张飞 克里木 尹东峰 吾木尔 刘剑 贾勇
[摘要]目的：采用低溫3D打印技术制备复合万古霉素的PLGA/TCP多孔骨缺损修复支架材料，并对其生物相容性和抑菌效果进行检测，旨在使支架材料促进骨缺损修复的同时，兼具局部抗感染的能力。方法：按15%PLGA+1.5%TCP+1.5%万古霉素的比例，应用低温快速3D打印技术制备了40%、60%和80%三种不同孔隙率的骨缺损修复支架材料，并对该材料进行表面形态观察和测量、细胞毒性检测、万古霉素缓释能力实验和抑菌效果检测。结果：扫描电子显微镜观察支架材料见其互连通性好，大孔直径在550μm左右，孔连通率在90%以上。三种不同孔隙率的支架材料均无细胞毒性，孔隙率为80%的支架材料在万古霉素缓释能力和抑菌效应方面要显著优于孔隙率为40%和60%的支架材料。结论：应用低温3D打印技术可以直接在生物墨水中加入注射用万古霉素粉剂，制备出具有良好三维结构的复万古霉素/PLGA/TCP的多孔支架材料，该支架孔通率高，互连通性好，而且当孔隙率为80%的支架材料在万古霉素缓释能力及抑菌效应方面有着更优的表现，可视为一种具有潜在临床应用价值的支架材料，尤其适用于感染性骨缺损的修复。
[关键词]低温3D打印;骨缺损修复支架;聚乳酸-羟基乙酸;磷酸三钙;万古霉素
[中图分类号]R622 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2021）05-0059-04
Preparation and Properties Study on the Low Temperature 3D Printing Composite Vancomycin/PLGA/TCP Scaffold
XU Gang1，HE Chun-qing1，ZHANG Fei1，KE Li-mu1，YIN Dong-feng2，WU Mu-er1，LIU Jian1，JIA Yong1
[1.Department of Traumatic Orthopedics，Orthopedic Center of PLA（Joint group）;2.Department of Pharmacy，General Hospital of Xinjiang Military Region，Urumuqi 830000，Xinjiang，China]
Abstract：
Objective To design via low temperature 3D printing composite scaffold （PLGA/TCP） made of poly （lactic-co-glycolic acid） （PLGA） and tricalcium phosphate （TCP） as a basic carrier， incorporating vancomycin powder. The structural and performance of such composite scaffold is tested， so as to make the scaffolds promote bone defect repair and have anti-infection ability. Methods According to the ratio of 15%PLGA+1.5%TCP+1.5% vancomycin， such scaffolds were fabricated using a low-temperature rapid-prototyping 3D printing process，and the porosity for 40%， 60% and 80% were designed. The surface morphology of the scaffolds were observed and measured， biocompatibility was evaluated by the cytotoxicity test of the bone marrow mesenchymal cells. The vancomycin release and antibacterial test were also observed in our study. Results The large pores diameter of the vancomycin incorporated PLGA/TCP scaffold is about 550μm and the pore connectivity is 90%. All scaffolds have good biocompatibility and no cytotoxicity. The results of vancomycin release and antibacterial test for scaffold with 80% porosity were significantly superior to those with porosity of 40% and 60%. Conclusion A new type of composite vancomycin incorporated PLGA/TCP porous scaffold was fabricated using low temperature rapid prototyping technology， and the scaffold with 80% porosity has better performance in Vancomycin release and antibacterial test， which means that scaffold can be a scaffold material with potential clinical application value， especially suitable for the repair of infectious bone defect.
Key words：
low temperature 3D print; bone defect repair scaffold; poly（lactic-co-glycolic acid）（PLGA）; tricalcium phosphate （TCP）; vancomycin
临床中由于骨与关节感染、结核或肿瘤侵蚀、严重创伤等导致的骨缺损比较常见，而大段骨缺损的修复成为骨科领域最为棘手的难题之一[1-3]。虽然骨移植术是修复骨缺损的传统方法，但自体骨在取骨时会造成供区新的骨缺损，增加了供区创伤及相关并发症;而异体骨虽来源广泛，但组织相容性低，存在排异反应，且对供区血运环境依赖大，均无法在临床中广泛推广，而人工合成骨材料因来源广泛，种类繁多，制备简单，不损伤供区和无免疫排斥性等优势成为骨科领域的研究热点之一[4-5]。诸多研究表明，聚乳酸-羟基乙酸[Poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]与磷酸三钙（Tricalcium phosphate，TCP）复合的多孔支架材料，具有生物相容性好、孔隙率高以及可体内降解吸收的特点，是人工骨移植的理想备选材料之一[6-9]。但是由于目前的复合材料不具备抗感染效应，在治疗感染性骨缺损中存在障碍，因此，制备一种复合抗生素的可降解人工骨移植材料具有十分重要的临床意义[6-7]。
传统的增材制造技术因工作温度高[8]，不能直接在打印墨水溶液中添加抗生素，多数研究都选择通过二次吸附添加的方式加入抗生素缓释成分，此类方法制备的材料缓释效率不稳定，难以满足临床要求，而低溫3D打印技术的诞生很好地解决了这一难题。该理念结合计算机辅助设计（Computer aided design，CAD）和计算机辅助制造（Computer aided manufacturing，CAM）技术，利用数控技术在低温（零下30℃～40℃）条件下按照CAD模型将复合高分子材料层层堆积制备临床所需要的个性化三维实体。低温技术的应用使得直接在打印墨水中添加抗生素成为可能。万古霉素是一种糖肽类抗革兰阳性菌抗生素，在治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的慢性骨髓炎中具有良好的临床疗效[10-11]。本研究结合上述研究进展，设计制备了一种复合万古霉素/PLGA/TCP的可降解多孔骨修复材料，并分析其生物相容性及药物缓释性能，为后续的动物实验研究提供可靠的理论依据。
1 材料和方法
1.1 主要仪器设备和材料：主要仪器设备：低温沉积生物3D打印机（北京上普博源生物科技有限公司，SUNP BP11），真空冷冻干燥机（北京松源华兴，LGJ-12），扫描电镜（日本Hitachi公司，SU8020），高分辨率小动物用微CT（美国GE公司），Multiskan Sky全波长酶标仪（Thermo），HP1100高效液相色谱仪（美国惠普）。
主要试剂：聚乳酸-羟基乙酸，PLGA75/25（山东省药学科学院中试厂，特性粘度：1.0±0.1dL/g），β-磷酸三钙（Sigma），1，4-二氧六环（Sigma），Percoll分离液（Pharmacia），OriCell人间充质干细胞培养基（广州赛业生物科技有限公司），0.25%胰蛋白酶/EDTA（HyClone），CCK-8试剂盒（Dojindo）。
1.2 新型复合万古霉素/PLGA/TCP支架的制备：低温快速成型3D打印PLGA/TCP支架已经有可重复验证的制作方法[12-13]。在此基础上将万古霉素粉剂（注射用盐酸万古霉素，希腊VIANEX S.A公司）按照一定比例加入打印墨水中，具体步骤及参数如下：①材料配制比例：PLGA、TCP和万古霉素粉末按10：1：1的质量比混合后，将粉体溶解在有机溶剂1，4-二氧六环中形成均质化溶液（粉体重量与溶液体积比值系18：100），装入3D打印机注射仓中备用;②用Mimics软件MEDCAD模块创建CAD模型，设置支架规格：长20mm、宽20mm、高15mm;③3D打印机打印多孔支架材料，打印机喷头温度35℃，口部直径0.6mm，打印速度9mm/s，平台温度-25℃，填充图案为锯齿状，走线距离1.8mm，打印规格：长20mm、宽20mm、高15mm，孔隙率分别设置为40%、60%及80%;④固化方式：将低温3D打印材料于-40℃下静置24min后转移至冷冻干燥机，设置真空度为10Pa，冷冻干燥48h，以1℃/h升温至20℃，此过程使有机溶剂（1，4-二氧六环）被完全移除，获得三种不同孔隙率的万古霉素/PLGA/TCP多孔支架材料。
1.3 支架形态观察：①肉眼及光学显微镜观察大体形态;②Micro-CT扫描支架并用Microview软件进行图像处理，三维重建并测量;③扫描电子显微镜观察新型万古霉素/PLGA/TCP支架：将打印好的支架切成5mm×5mm×5mm大小，2.5%戊二醛-PBS固定，并梯度脱水后喷金。将固定有支架样品的金属底座移至扫描电镜内，调整坐标参数及焦距，真空条件下观察支架表面微观结构并记录照片。
1.4 骨髓间充质干细胞提取与传代培养：从Sprague-Dawley大鼠的骨髓中提取间充质干细胞，将细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育。培养3d后首次换液，以后每2～3d更换培养液。待细胞长满单层，使用0.25%胰酶进行消化，传代培养。
1.5 支架的体外细胞相容性测试：将3种不同孔隙率的支架材料的浸提液和正常培养基分别制作细胞悬液，浓度为1×108/L。将4种悬液加入96孔板中，每孔100μl，在37℃培养箱中培养1、3、5、7d，每2d更换一次培养液。各时间点每孔加入10μl CCK-8试剂，酶标仪检测450nm波长下各孔的吸光度值，记录并进行统计学分析。
1.6 支架的药物缓释能力：将3种不同孔隙率的支架材料分别放入6个试管中，每管加入10ml的PBS（pH值7.4），每24h换液1次，收集第1、5、10、15、20、25、30天的24h洗提液，用高效液相色谱仪检测洗提液中万古霉素的浓度。
1.7 支架的抑菌实验测试：将3种不同孔隙率的支架材料分别放入6个均匀涂有1.5×108金黄色葡萄球菌的MH琼脂培养皿中，37℃培养24h后测量并记录抑菌圈大小。以后每3d更换一次培养皿，测量并记录第10、15、20、25、30天的抑菌圈大小。
1.8 统计学分析：数据统计分析以及制图运用Graph Pad Prism version 5（GraphPad software， San Diego，CA）软件，不同组间比较采用方差分析（ANOVA），P<0.05表示差异具有统计学意義。
2 结果
2.1 支架形态观察：复合万古霉素/PLGA/TCP支架材料在肉眼和光镜下可见均匀分布的大孔。CT扫描见支架内部每个层面孔隙分布均匀，每层之间相互连通，没有内部孔隙堵塞。支架大孔直径在550μm左右，孔连通率在90%以上，3种支架材料的孔隙率（40%、60%、80%）基本达标。扫描电子显微镜观察复合支架材料可见孔壁上分布大量的微孔，2.5～90μm不等，互连通性良好。孔壁有较大的比表面积和粗糙度，与正常松质骨结构较为接近。
2.2 体外细胞毒性实验：三种不同孔隙率的复合支架材料的浸提液与间充质干细胞共培养，在第1天、第3天、第5天、第7天对细胞增殖的作用与正常培养基组比较差异无统计学意义（P>0.05），即复合万古霉素/PLGA/TCP的多孔骨修复材料对骨髓间充质干细胞无明显细胞毒性。
2.3 万古霉素的缓释结果：三种不同孔隙率的复合支架材料在前10d的万古霉素缓释能力相当，均维持在50g/L标准以上。但在第15天后，40%孔隙率组和60%孔隙率组的万古霉素缓释效率显著低于80%孔隙率组，差异有统计学意义（P<0.05），且无法维持在50g/L之上。证明孔隙率为80%的复合万古霉素/PLGA/TCP的多孔骨修复材料具有较好的缓释效应。
2.4 抑菌实验结果：三种不同孔隙率的复合支架材料在前15d的抑菌能力相当，无明显差异。但在第20天时，40%孔隙率组和60%孔隙率组的抑菌圈开始缩小，与80%孔隙率组比较差异有统计学意义（P<0.05）。证明孔隙率为80%的复合万古霉素/PLGA/TCP的多孔骨修复材料具有更长的抑菌效果。
3 讨论
慢性骨髓炎造成的节段性骨缺损的治疗一直是骨科领域的一大难题[3-4]。虽然自体骨移植是治疗的金标准，但由于其来源的局限性及对供区的损伤，目前使用人工骨移植材料进行治疗是临床上最常见的选择之一。临床上的实际需求不断推动着人工骨材料的演变发展，现在要求内植物不仅能填补骨缺损空间，提供有效的力学支撑，还要具有抗感染和促进成骨的作用。本研究制备的新型复合万古霉素/PLGA/TCP支架材料制备价格低廉，初期能提供力学支撑，具有稳定的生物学活性，能够促进新骨形成，允许新生血管早期长入，并且材料可逐渐生物降解[12-15]。PLGA和β-TCP都是经国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准使用的生物材料，PLGA适用于低温快速沉积工艺，β-TCP粉末不仅能改善材料的理化性质，而且在体内应用有很好的骨诱导性，两种材料组合打印出的支架材料的力学强度较单纯PLGA支架高[15-16]。
但万古霉素在骨组织中的渗透能力较差，对于慢性骨髓炎的患者很难通过静脉用药控制感染，而复合万古霉素/PLGA/TCP支架材料的制备将有效解决这一问题。通过调整PLGA、β-TCP、万古霉素三种成分在多孔支架内的配比，设置3D低温快速成型技术中的关键参数，可实现β-TCP、万古霉素在多孔支架中的均质化分布，制备出具有合适孔径和孔连通率、高孔隙率、不同微观结构的复合万古霉素/PLGA/TCP支架材料，实现控制局部感染及重建骨缺损的作用[17-19]。
从光镜、显微CT和扫描电镜的观察结果可知，多孔支架最大可达到80%的孔隙率和90%的孔连接率。从仿生学的角度来看，多孔支架的结构与天然松质骨的结构类似，三维蜂窝状结构的表面孔和内部孔互有连通，有利于骨细胞直接粘着、分泌及构建细胞外基质网络，逐渐完成骨基质的矿盐沉积，有利于向血管分化的干细胞的直接粘附、增殖和分化[20-21]。孔径在200～300μm的支架材料有利于体内活性骨细胞及新生微血管的长入;孔隙率大于75%能保证多孔支架与周围组织最大限度地接触并逐渐结合，使支架具有较好的骨传导性;孔连通率大于85%能保证多孔支架表面粘附不同来源的干细胞，促进干细胞迁移进入支架内部，有利于不同分化阶段的成体细胞进行新陈代谢。体外生物相容性测试证实，复合万古霉素/PLGA/TCP的支架材料对人骨髓间充质干细胞不具有细胞毒性。万古霉素缓释能力测试发现，三种不同孔隙率的支架材料均有着良好的药物缓释能力，而80%孔隙率的材料缓释能力更优，20d内可维持在50mg/L以上。而且体外抑菌实验更加证实孔隙率为80%的支架材料相比其余两组有更好的长期抑菌效果。将万古霉素加入骨修复材料中，并使其在支架材料中有序释放，不仅可以促进骨缺损的修复，还可以使药物在感染部位达到有效浓度，降低药物全身应用的毒副作用。
这种新型复合万古霉素/PLGA/TCP的多孔支架材料将三类性质不同的生物材料（万古霉素、PLGA、β-TCP）有机地整合成一种支架材料，通过控制多孔支架的各项理化属性，可以灵活地制备不同微观结构的多孔支架，临床上也可以视具体情况选择合适的支架形状，实现精准高效地制备具有原生抗感染作用的人工骨缺损修复材料的目地。
应用低温3D打印技术可以直接在墨水溶液中加入注射用万古霉素粉剂，成功制备出新型复合万古霉素/PLGA/TCP多孔支架。该支架材料孔隙率高，具有良好的生物相容性、药物缓释能力和抗菌作用，同时有利于组织液渗透和细胞附着，对于治疗感染性节段性骨缺损具有重要的临床意义。
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[收稿日期]2021-03-03
本文引用格式：许刚，何纯青，张飞，等.低温3D打印复合万古霉素/PLGA/TCP骨修复材料的制备与性能评估[J].中国美容医学，2021，30（5）：59-62.
