金丹丹 房岩 费瑞 郝凤桐 马金理 杨文卓
摘 要：白英含有多种化学成分，具有潜在的药用价值和开发前景，但抗炎机制的研究并不完整。本实验以小鼠RAW264.7细胞为材料，研究白英甾体化合物的抗炎作用机制，研究发现：白英甾体化合物能明显抑制产生炎症的小鼠RAW264.7细胞的TNF-α的炎症因子的表达，提高炎症细胞的线粒体膜电位，白英甾体化合物可能是通过保护线粒体来实现其抗炎作用。
关键词：白英甾体化合物;TNF-α;线粒体膜电位;抗炎
中图分类号：S-3 文献标识码：A DOI：10.19754/j.nyyjs.20201130001
炎症是机体自发产生的一种正常反应，但如果反应过度，又会给机体带来损伤。如何有效控制炎症的过度损伤，减轻炎症对身体带来的危害，是如今所要研究的重要课题，对人类健康具有重要意义[1]。白英，又叫鬼目草、葫芦草等，是茄科茄属植物，属多年生蔓性草本植物，分布十分广泛[2]。白英有很大的药用价值，其全草以及根部都可供药用。目前临床上对于白英的应用越来越多，在消肿解毒、抗肿瘤等方面尤为显著。近年来，各研究学者开始对白英的抗炎作用进行研究，发现白英具有较好抗炎效果。研究表明，白英主要通过其各种化学成分发挥作用[3]。TNF-α是非常重要的一种炎症因子，能够反映细胞的炎症水平，抑制TNF-α的表达，可以达到抗炎的目的。线粒体是真核生物非常重要的细胞器，在机体中发挥重要的作用，当机体产生炎症时，线粒体会发生很明显的变化，包括上调ROS水平、降低线粒体膜电位等，可以通过这些指标来观察线粒体的情况，因此，研究白英甾体化合物的抗炎作用与对线粒体的关系具有重要意义。
1 材料
1.1 仪器
细胞培养箱;超净工作台;酶标仪;倒置显微镜;电子天平;低速离心机;荧光显微镜等。
1.2 试剂
DMEM培养基;胎牛血清;PBS;双抗;CCK-8试剂;TNF-α的ELISA检测试剂盒;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）。
1.3 药品与细胞
白英甾体化合物干粉由吉林省中医中药研究院馈赠，利用PBS使其溶解，实验所需细胞为小鼠RAW264.7细胞购自中国细胞库，对照组为地塞米松。
2 方法
2.1 药品配制及细胞培养
取白英甾体化合物的干粉，用PBS将其溶解，然后过滤并进行高压灭菌。小鼠RAW264.7细胞用DMEM培养基进行培养，加入胎牛血清和双抗（青霉素、链霉素），在37℃、5%CO2的細胞培养箱中进行传代培养，培养至对数生长期可供实验使用。
2.2 白英甾体化合物对小鼠RAW264.7细胞活力的影响
取培养的小鼠RAW264.7细胞，加入培养基并轻轻吹打，使细胞悬浮到液体中，加入到96孔板中，使每孔体积200μL，细胞密度为1×104mL/个，放入培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长，然后把孔内液体吸出，加入含有不同浓度的白英甾体化合物的DMEM培养基，并加入LPS，分为5组：空白组，白英甾体化合物高、中、低剂量组（白英甾体化合物的浓度分别为40μg·mL-1、20μg·mL-1、5μg·mL-1），地塞米松阳性对照组[4]。
2.3 CCK-8法测定细胞活力
上述5组作用24h后，每孔加入10μLCCK-8，静置30min，把酶标仪的波长调至450nm，测定上述各孔吸收的OD值。
2.4 白英甾体化合物对小鼠RAW264.7细胞TNF-α表达的影响
细胞培养同上所述，分组情况同上，按照TNF-α的ELISA检测试剂盒的说明书进行操作，测量小鼠RAW264.7的炎症因子的表达情况。
2.5 白英甾体化合物对小鼠RAW264.7细胞线粒体膜电位的影响
在上述培养的细胞中，加入脂多糖，按照分组浓度，加入白英甾体化合物，在细胞培养箱中培养24h后，每组取1×105个细胞，重悬于0.5mL细胞培养液中，按照线粒体膜电位检测试剂盒的说明书进行操作，以测定线粒体膜电位的变化情况[5]。
2.6 数据的统计分析
使用Graphpad Prism 5.0软件对试验数据进行统计学分析。
3 结果
3.1 白英甾体化合物对小鼠RAW264.7细胞活力的影响
结果显示，与空白组相比较，白英甾体化合物的高中低剂量组和阳性对照组细胞活性明显偏低，白英甾体化合物的高中低剂量组又高于地塞米松组，但各组之间无统计学差异（P>0.05）。说明在试验浓度范围内，不同浓度的甾体化合物和地塞米松不影响小鼠RAW264.7细胞活性，对小鼠RAW264.7细胞没有毒性作用，与林世和等研究结果一致[6]。
3.2 白英甾体化合物对小鼠RAW264.7细胞TNF-α表达的影响
结果显示，与空白组比较，LPS显著提升了小鼠RAW264.7细胞TNF-α的表达，其差异具有统计学意义（P<0.05），说明LPS诱导细胞产生炎症，模型构建成功。与LPS组比较，40μg·mL-1和20μg·mL-1的甾体化合物与地塞米松能够抑制小鼠RAW264.7细胞TNF-α的表达，其差异具有统计学意义（P<0.05），说明白英甾体化合物具有较好的抗炎作用。5μg·mL-1的甾体化合物则没有显示出抑制小鼠RAW264.7细胞TNF-α的表达的作用，对比LPS组，其差异无统计学意义（P>0.05），说明白英甾体化合物浓度较低时，其作用效果不明显，与刘淑华等研究结果一致[4]。
3.3 白英甾体化合物对小鼠RAW264.7细胞线粒体膜电位的影响
通过JC-1法测定线粒体膜电位，用红、绿2种颜色的荧光分别表示线粒体膜电位的高、低。结果显示，空白组呈现红色荧光，LPS组为绿色荧光，说明在LPS的刺激下，细胞产生炎症;当加入白英甾体化合物后，线粒体膜电位有所提高，并且以剂量依赖性的方式增强线粒体膜电位，说明炎症反应得到抑制。
4 讨论
试验以小鼠RAW264.7细胞为试验材料，通过LPS刺激诱导细胞产生炎症，以研究白英甾体化合物的抗炎作用与功效[7]。试验首先研究了白英甾体化合物对小鼠RAW264.7细胞的毒性作用，结果显示，白英甾体化合物和地塞米松对细胞活性有影响，使细胞活力OD值下降，但各组之间无统计学差异，说明白英甾体化合物对细胞没有毒性作用。TNF-α是炎症反应的一个重要指标，通过ELISA检测了各组TNF-α的表达水平，LPS刺激细胞产生炎症，TNF-α的表达较高，但在白英甾体化合物作用的情况下，中、高浓度明显抑制了TNF-α的表达，具有统计学差异，低浓度则没有出现抑制作用，没有统计学差异，说明低浓度的白英甾体化合物抗炎作用不明显。为了明确白英甾体化合物的抗炎机制，通过JC-1法测量了线粒体膜电位，空白组呈红色荧光，线粒体膜电位较高，LPS刺激后，呈现绿色荧光，膜电位下降，白英甾体化合物作用后，红色荧光比例提高，说明白英明显提高了线粒体膜电位。由此得出结论，白英甾体化合物能明显抑制产生炎症的小鼠RAW264.7细胞的TNF-α的炎症因子的表达水平，提高炎症细胞的线粒体膜电位，白英甾体化合物可能是通过保护线粒体来实现其抗炎作用[8]。
参考文献
[1]蔡艳春，黄倩，危晓莉，等.红景天苷对脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞共培养炎性介质分泌的影响[J].生理学报，2019，71（04）：575-580.
[2]孙立新，毕开顺，王敏伟.中药白英的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2006（04）：251-255.
[3]孙立新，任靖，王敏伟，等.白英水提物抗肿瘤作用的初步研究[J].中草药，2006（01）：98-100.
[4]刘淑华，毛晓红，魏仙凤.白英甾体皂苷对HeLa细胞增殖的高效抑制作用及机制研究[J].山东中医杂志，2009，28（10）：724-726.
[5]韩孝先，刘泽宇，周庆彪，等.线粒体在炎症调控中的作用研究进展[J].癌变·畸变·突变，2017，29（06）：467-470，475.
[6]林世和，易艳东，余南才.白英总皂苷的抗炎活性研究[J].中国医院药学杂志，2016，36（07）：564-567.
[7]张丽娇，高立宏，费瑞.银杏叶多糖对炎症小鼠TNF-α表达的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2018（16）：172-173.
[8]刘芬，曾振国，李勇，等.体DNA诱导肺泡巨噬细胞炎症反应的实验研究[J].南昌大学学报（医学版），2014，54（01）：1-3.
（责任编辑 李媛媛）
收稿日期：2020-10-23
基金项目：吉林省自然科学基金项目“吉林省科技发展计划项目白英的抗炎活性成分及以TLR4为靶点的相关机制研究”（项目编号：20180101112JC）;国家自然科学基金项目（項目编号：50875108）
作者简介：金丹丹（1995-），女，硕士在读。研究方向：功能生物学;费瑞（1964-），男，博士，教授。研究方向：生物活性物质活性;郝凤桐（1997-），男，硕士在读。研究方向：生物学;马金理（1997-），男，本科在读;杨文卓（1999-），男，本科在读;通讯作者房岩（1965-），女，博士，教授。研究方向：动物学和工程仿生学。
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