韩月 李占君 李梦媛 杨逢建
摘 要：为研究油桦中三萜类化合物的提取工艺，以油桦树皮为原料，采用超声法提取三萜类化合物，建立油桦中三萜类化合物的高效液相色谱测定方法。应用单因素实验和响应面法考察不同超声因素对油桦中三萜类化合物总提取率的影响。最后得到的最佳条件为：超声功率380 W，提取时间42 min，提取温度63 ℃。油桦三萜类化合物的总提取率为280.72%，与理论推测值281.54%±0.55%一致。结果表明，超声法提取三萜类化合物工艺合理可靠，提取率高。
关键词：油桦;三萜类化合物;高效液相色谱法;超声提取;响应面优化
中图分类号：TQ654.2;TS205.4 文献标识码：A 文章编号：1006-8023（2021）02-0079-07
Optimization of the Extraction Process of Triterpenoids
from Betula ovalifolia by Response Surface
HAN Yue1， LI Zhanjun2， LI Mengyuan1， YANG Fengjian1*
（1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology， Ministry of Education， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;
2.Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry， Yichun 153000， China）
Abstract：In order to study the extraction process of triterpenoids in Betula ovalifolia， the Betula ovalifolia bark was used as raw material to extract triterpenoids by ultrasonic method， and a high performance liquid chromatography method for the determination of triterpenoids in Betula ovalifolia was established. Single factor experiment and response surface method were used to investigate the effect of different ultrasonic factors on the total extraction yield of triterpenoids in Betula ovalifolia. The best condition obtained in the end was：
ultrasonic power was 380 W， extraction time was 42 min， extraction temperature was 63 ℃. The total extraction yield of triterpenoids from Betula ovalifolia was 280.72%， which was consistent with the theoretically estimated value of 281.54% ± 0.55%. The results showed that the ultrasonic extraction of triterpenoids was reasonable and reliable， and the extraction rate was high.
Keywords：Betula ovalifolia; triterpenoids; high performance liquid chromatography; ultrasonic extraction; RSM
收稿日期：2020-11-09
基金項目：黑龙江省林业科技项目（Hljlykj2018-1）
第一作者简介：韩月，硕士研究生。研究方向为植物资源学。E-mail：
1515538905@qq.com
通信作者：杨逢建，博士，教授。研究方向为植物资源学。E-mail：
yangfj@nefu.edu.cn
引文格式：韩月，李占君，李梦媛，等. 响应面优化油桦中三萜类化合物提取工艺[J].森林工程，2021，37（1）：79-85.
HAN Y， LI Z J， LI M Y， et al. Optimization of the extraction process of triterpenoids from Betula ovalifolia by response surface[J]. Forest Engineering，2021，37（1）：79-85.
0 绪论
油桦（Betula ovalifolia）是桦木科桦木属的一种灌木，分布于中国东北部地区[1]。近年来，从天然植物中提取和分离活性物质用于临床药物的研究和开发已成为人们关注的热点。研究发现，桦树皮中含有大量的三萜类化合物，功效应用广[2-4]。其中白桦脂酸、白桦脂醇和羽扇豆醇等为桦树皮中的天然活性成分。三萜类化合物具有抗肿瘤、抗炎和抗病毒的作用。特别是针对艾滋病具有良好的生物学抗性，在药物研发中有很高的利用价值[5-8]。
目前对樺木属植物的研究主要集中在白桦树皮中三萜类化合物的提取分离、结构鉴定等方面[9-12]。而对油桦的研究大多集中在植被覆盖、群落生态以及林下经济等方面，其活性物质的提取以及含量的测定未见报道[13-15]。
超声提取具有操作简单、超声水浴可同时做多个样品、实验效率高、超声波震动作用能使物质充分溶出、提取率高等特点，使其成为提取植物中天然活性成分的常用方式[16-17]。小兴安岭植物资源众多，油桦分布广泛，其中的天然活性成分具有很大的药用价值和发展前景。本实验以乙酸乙酯为提取溶剂，超声辅助提取，利用单因素实验和响应面法对油桦中三萜类化合物的提取工艺进行优化，为油桦中三萜类化合物的开发利用提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
油桦树皮于2020年6月在黑龙江省小兴安岭采集。实验用品：白桦脂酸、白桦脂醇、羽扇豆醇标准品（上海源叶生物科技有限公司）、实验用超纯水（实验室自制）、乙酸乙酯（天津富宇精细化工有限公司）、色谱乙酸（天津科密欧化学试剂有限公司）、色谱级乙腈（SK公司）、色谱级甲醇（SK公司）等药品均为分析纯。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（型号：1260，美国安捷伦公司）;电子分析天平（型号：UH620H，日本SHIMADZU岛津）;医用离心机（型号：H1650，长沙市高新技术产业开发区湘仪离心机器有限公司）;数控超声波清洗机（型号：JP-100ST，深圳市洁盟清洗设备有限公司）等。
2 实验方法
2.1 供试品溶液的制备
将油桦树皮置60 ℃鼓风干燥箱干燥，粉碎机破碎，过筛，收集起来备用。取油桦树皮粉末0.5 g，倒入25 mL容量瓶中，加入提取溶剂乙酸乙酯10 mL，超声处理30 min;制备完毕，将提取混合溶液放置室温冷却，定容摇匀。用移液枪吸取提取液5 mL，移入10 mL离心管，高速（10 000 r/min）离心10 min，取上清液即为待测溶液。
2.2 液相色谱条件
Diamonsil-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。白桦脂酸、白桦脂醇检测条件：
流动相A为乙腈（含0.1 %乙酸），流动相B为水（含0.1 %乙酸），梯度洗脱，洗脱程序见表1[18];柱温为30 ℃;检测波长为210 nm;进样量为10 μL。羽扇豆醇检测条件：以100%甲醇为流动相;流速为1.2 mL/min;柱温为25 ℃;检测波长为210 nm;进样量为10 μL[19]。
2.3 标准曲线的建立
将白桦脂酸、白桦脂醇、羽扇豆醇3种标准品分别溶于无水乙醇，0.45 μm有机膜过滤，得到质量浓度为1 mg/mL的母液，用无水乙醇将白桦脂酸、白桦脂醇、羽扇豆醇的母液依次稀释质量浓度为31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg/mL的标准品溶液。用液相色谱确定标准物质的出峰时间，以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行回归分析。得到：白桦脂酸回归方程为y=7 360.9x-5.947 3（R2=0.999 6），线性范围为31.25～1 000 μg/mL;白桦脂醇回归方程为 y=7 597.8x+29.983（R2=0.999 5），线性范围为31.25～1 000 μg/mL;羽扇豆醇回归方程为y=3 018.8x+11.911（R2=0.999 8），线性范围为31.25～1 000 μg/mL。对照品及样品色谱图如图1和图2所示。
2.4 总提取率的测定
将供试品溶液测得的峰面积代入标准曲线中，分别计算出油桦树皮中所含白桦脂酸、白桦脂醇和羽扇豆醇3种有效物质的提取率，计算公式为：
Y0 = （M1 / M2） × 100%。 （1）
式中：Y0为有效物质得率，%;M1为有效物质提取所得质量的算术平均值，g;M2为未经提取处理前油桦树皮粉末质量，g。
Y1 =（ Ma / Mb））× 100%。 （2）
式中：Y1为有效物质含有率，%;Ma为有效物质完全充分提取所得质量的算术平均值，g;Mb为未经提取处理前油桦树皮粉末质量，g。
Y2 = （Y0 / Y1 ）× 100%。 （3）
式中：Y2为有效物质提取率，%;Y0为有效物质得率，%;Y1为有效物质含有率，%。
Y总 = y1 +y2 +y3。 （4）
式中：Y总为总提取率，%;y1为白桦脂酸提取率，%; y2为白桦脂醇提取率，%; y3为羽扇豆醇提取率，%。
2.5 数据统计与处理
实验操作过程中，数据的统计与处理用 Origin Pro 9.0和Design Expert 10。
2.6 单因素实验
2.6.1 不同功率对总提取率的影响
具体操作为：称取干燥过的树皮粉末0.5 g，固定水浴温度30 ℃，液料比15∶1 mL/g，时间30 min，研究功率为200、300、400、500、600 W条件下对总提取率的影响。
2.6.2 不同液料比对总提取率的影响
称取干燥后的树皮粉末0.5 g。固定条件：功率400 W，水浴温度30 ℃，时间30 min，考查液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g对总提取率的影响。
2.6.3 不同提取時间对总提取率的影响
称取干燥树皮粉末0.5 g，固定功率400 W，水浴温度30 ℃，液料比20∶1 mL/g，分别研究10、20、30、40、50 min条件下对总提取率的影响。
2.6.4 不同提取温度对总提取率的影响
称取干燥树皮粉末0.5 g，固定功率400 W，液料比20∶1 mL/g，时间40 min，探讨温度30、40、50、60、70 ℃对总提取率的影响。
2.7 响应面法优化提取工艺
根据单因素实验结果，选取对总提取率影响程度较高的因素：超声功率、超声时间、水浴温度作为自变量，采用三因素三水平设计Box-Behnken Design实验，实验因素与水平见表2。
3 结果与分析
3.1 单因素实验结果分析
3.1.1 不同提取功率对总提取率的影响
随着功率的增加，总提取率先升高后降低（图3），当超声功率达到400 W时，总提取率达到最大值;功率在400 W后，总提取率开始下降。主要原因在于超声的空化作用和直进流作用在400 W时达到了饱和状态，使溶质充分溶解，所以超声功率为400 W。
3.1.2 不同液料比对总提取率的影响
液料比不断增大，总提取率逐渐上升，当液料比达到20∶1 mL/g时，总提取率最高（图4），表明溶质的渗出率高，在溶剂中的溶解度达到了动态平衡。进一步增加溶剂的用量，总提取率下降。由于溶剂的增多致使三萜类化合物的含量下降，液料比以20∶1 mL/g进行下一步的实验。
3.1.3 不同提取时间对总提取率的影响
随着超声时间的延长，总提取率逐渐升高，延长时间，溶质溶解的较好，但40 min之后总提取率趋于稳定甚至略有下降（图5）。当油桦中的三萜类有效成分在溶剂扩散过程中达到平衡时，总提取率随提取时间的延长无明显变化，因此选用提取时间为40 min进行下一步的优化设计。
3.1.4 不同提取温度对总提取率的影响
在40～60 ℃，随着提取温度的增加，总提取率逐渐增大（图6）。在60 ℃时达到了较好的提取效果，其原因是温度高、介质溶出速率高、渗透速度快、溶解度大，提高了总提取率。但是过高的温度，易使溶剂挥发和破坏物质本身的结构，影响提取率。因此最佳提取温度为60 ℃。
3.2 响应面优化实验结果
3.2.1 模型的建立及显著性检验
按照表2的实验设计，进行Box-Behnken响应面设计，根据表3实验数据进行多元回归拟合，得到的回归方程为：
Y（%）=+280.08-5.36A+4.26B+3.41C-1.35AB-0.17AC+3.51BC-12.61A2-14.95B2-7.51C2。
根据表4方差分析结果来看，该拟合优化模型F=80.72，P< 0.01，表明该拟合优化模型差异极显著，而失拟项中F=3.80，P=0.115 2>0.05，表示差异不显著，模型拟合度良好。且A、B、C各因素之间互不干扰。该实验设计能较好地反映提取功率、提取时间和提取温度对总提取率的显著影响。模型中的单一因素功率（A）、时间（B）、温度（C）和二次项中的A2、B2、C2，以及组合性因素中的BC的P值均小于0.01，表明对油桦三萜类化合物总提取率有极显著影响;组合性因素AB、AC的P值均大于0.05，影响不显著，说明交互作用弱。根据F值的大小，判断各超声因素对总提取率影响的强弱为：A>B>C，3者共同影响三萜类化合物的总提取率。
拟合优化模型的综合决定系数和校正决定系数分别为R2 = 0.990 5和AdjR2 = 0.978 2（表5）。表明回归模型具有较高的拟合度，模型和方程可以用来推断实验结果，该模型可用于优化油桦中三萜类化合物的提取工艺。
3.2.2 响应面优化伞状图
响应面底部的投影是一个等高线图，等高线图的形状反映了这2个因素之间的相互作用。图7底部的投影为圆形，表明功率A和时间B的交互作用不显著，图8底部的投影为圆形，表示功率A和温度C之间的相互作用不显著，图9底部的投影为椭圆形，表示时间B和温度C的交互作用强，即时间和温度的交互作用对油桦中三萜类化合物的提取率影响显著，这与响应面优化的模型方程方差分析结果相符。
3.2.3 最优工艺条件的验证与对比实验
通过回归模型分析，确定最佳实验条件为：超声功率377.59 W，提取时间41.84 min，提取温度62.72 ℃。在此条件下，三萜类化合物的总提取率达到281.54%。考虑到实际情况的可操作性，调整
参数为：超声功率380 W，提取时间42 min，提取温度63 ℃。进行3次重复实验验证，得到的总提取率值为280.72%，与理论值281.54% ± 0.55%接近，表明优化的条件可靠，具有实际应用价值。
4 结论
本实验以乙酸乙酯为溶剂，采用超声提取，利用高效液相色谱法检测三萜类化合物含量。通过单因素实验确定了三萜类化合物的提取条件，采用响应面法建立了油桦中三萜类化合物总提取率的回归模型。根据拟合优化模型，各超声因素对总提取率的影响由大到小顺序为：功率（A）、时间（B）、温度（C）。获得的最佳提取条件为：超声功率380 W，提取时间42 min，提取温度63 ℃，总提取率为280.72%。这与曾慧慧等[20]研究的超声提取海南眼树莲中三萜类化合物获得的工艺条件基本相符，与理论预测值281.54%±0.55%偏差不大，实验结果较好。该工艺条件可为油桦中三萜类化合物的进一步开发利用提供依据。
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