熊雨 刘洁 邹攀 苏芮 钟文良 江志超 王贤文 何迎春
〔摘要〕 目的 探討益气解毒方中苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸对人鼻咽癌CNE2细胞增殖效应的抑制作用及机制研究。方法 使用实时无标记细胞功能分析技术（RTCA）动态监测不同浓度的3种苯丙素类化合物对离体人鼻咽癌CNE2细胞生长曲线的影响;CytationTM 5高通量活细胞成像分析检测系统分别监测3种不同浓度苯丙素类化合物对人鼻咽癌CNE2细胞形态改变;Western blot法检测3种苯丙素类化合物对人鼻咽癌CNE2细胞增殖相关蛋白增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）、X连锁的凋亡蛋白抑制剂（X-linked inhibitor of apoptosis protein， XIAP）、Survivin表达的影响。结果 RTCA实时监测结果显示异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸均能不同程度地抑制CNE2细胞增殖，存在药物浓度越高抑制效应越明显的趋势。CytationTM 5检测结果显示，与对照组相比，3种苯丙素类化合物作用36 h后，大量CNE2细胞出现细胞漂浮死亡，细胞膜破溃、细胞结构模糊等形态变化。Western blot检测结果显示，与对照组相比，异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸能明显抑制CNE2细胞中增殖相关蛋白PCNA、XIAP、Survivin的表达（P<0.05）。结论 益气解毒方中主要苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸均可以不同程度抑制人鼻咽癌CNE2细胞增殖，其机制可能与下调增殖相关蛋白PCNA、XIAP、Survivin的表达有关。
〔关键词〕 鼻咽癌;益气解毒方;苯丙素类化合物;细胞增殖;异欧前胡素;阿魏酸;绿原酸
〔中图分类号〕R285.5 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.05.009
Effects of the Phenylpropanoids in Yiqi Jiedu Formula on the Proliferation of
Nasopharyngeal Carcinoma Cells
XIONG Yu1， LIU Jie1， ZOU Pan1， SU Rui1， ZHONG Wenliang1， JIANG Zhichao2， WANG Xianwen3，4，5， HE Yingchun1，4，5*
（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Brain Hospital of Hunan Province， Changsha， Hunan 410005， China; 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 4. Hunan Provincial Engineering and Technological Research Center for Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Chinese Medicine and Protecting Visual Function， Changsha， Hunan 410208， China; 5. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）
〔Abstract〕 Objective To investigate the inhibitory effect and mechanism of the phenylpropanoid compounds isoimperatorin， ferulic acid and chlorogenic acid in Yiqi Jiedu Formula on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. Methods Real-time unlabeled cell function analysis technique （RTCA） was used to dynamically monitor the effects of three phenylpropanoids at different concentrations on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. CytationTM 5 high-throughput live cell imaging analysis system was used to monitor the effects of three phenylpropanoids at different concentrations on the morphological changes of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. Western blot method was used to detect the effects of three phenylpropanoids on human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， X-linked inhibitor of apoptosis protein （XIAP）， and Survivin expression. Results RTCA results showed that isoperatorin， ferulic acid， and chlorogenic acid can inhibit the proliferation of CNE2 cells to varying degrees， and there was a trend that the higher the drug concentration， the more obvious the inhibitory effect. The CytationTM 5 results showed that compared with the control group， a large number of CNE2 cells had cell floating death， cell membrane rupture， cell structure fuzzy and other morphological changes after the three phenylpropanoids were treated for 36 hours. Western blot detection results showed that compared with the control group， isoperatorin， ferulic acid， and chlorogenic acid can significantly inhibit the expression of proliferation-related proteins PCNA， XIAP， and Survivin in CNE2 cells （P<0.05）. Conclusion The main phenylpropanoid compounds， isoimperatorin， ferulic acid and chlorogenic acid in Yiqi Jiedu Formula， which can inhibit the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells to varying degrees. The mechanism may be related to the down-regulation of proliferation-related proteins PCNA， XIAP， and Survivin expression level.
〔Keywords〕 nasopharyngeal carcinoma; Yiqi Jiedu Formula; phenylpropanoid compounds; cell proliferation; isoimperatorin; ferulic acid; chlorogenic acid
鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）为发生在鼻咽上皮内壁的头颈部高发恶性肿瘤，发病率具有明显的地域倾向和种族差异，在中国南方、北非和东南亚发病率较高[1]。我国传统中医药在治疗NPC患者方面有独特优势，和单纯放疗相比，中西医结合疗法能有效改善NPC患者口腔黏膜不良反应、胃肠道不良反应及唾液腺损伤情况等，并能有效提高患者生活质量[2]。益气解毒方是本课题组研究和应用了二十几年的经验方，为田道法教授等针对NPC的“气虚染毒”的中医病机，根据“益气解毒，生津润燥”立法研制，课题组前期研究[3-4]已验证益气解毒方可以有效抑制NPC细胞增殖。益气解毒方中苯丙素类化合物来自党参异欧前胡素（isoimperatorin）及君药黄连中阿魏酸（ferulic acid）、绿原酸（chlorogenic acid），已有研究发现这几类中药单体具有镇痛抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性，对多种肿瘤细胞株具有抑增殖促凋亡效应[5-8]。
为了进一步佐证益气解毒方中苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸对人离体NPC细胞株增殖效应的影响及机制，本研究通过实时无标记细胞功能分析技术（real-time unlabeled cell function analysis technique， RTCA）、CytationTM 5细胞成像实时监测、Western blot等分别从整体效应、形态变化及蛋白质表达水平探讨这些中药单体对NPC CNE2细胞增殖效应作用，进一步阐明益气解毒方的药效发挥机制。
1 材料
1.1 细胞株
人NPC细胞株CNE2（BNCC341794），购于北京北纳创联生物技术研究院，由本实验室传代培养。
1.2 药物与试剂
异欧前胡素（质量分数≥98%，20180522）、阿魏酸（质量分数≥98%，20160519）、绿原酸（质量分数
≥98%，20180311）均购自上海金穗生物科技有限公司;抗体β-actin（3700S）、XIAP（14334P）、Survivin（2808S）均购自美国CST公司;PCNA抗体（bs-0754R， 北京博奥森生物技术有限公司）;IRDye 680RD 羊抗鼠二抗（C70417-02）、IRDye 800CW羊抗兔二抗（C70420-01）均购自美国LI-COR公司;RPMI-1640培养基（AE29163437）、PBS缓冲液（SH30256.01B）均购自美国HyClone公司;青霉素-链霉素溶液（WH01112004XP）、含0.25%EDTA胰蛋白酶溶液（WH01122008XP）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司;胎牛血清（42A0378K）购自美国Gibco公司。
1.3 实验仪器
双人单面洁净工作台（SJ-CJ-2FD，苏州苏洁净化设备有限公司）;二氧化碳细胞培养箱（CCL-170B-8，新加坡ESCO公司）;医用离心机（L535R，湖南湘仪实验室仪器开发公司）;倒置相差生物显微镜（AE31，麦克奥迪实业集团有限公司）;实时无标记细胞分析仪（RTCA DP，美国ACEA公司）;多功能微孔板检测系统（CytationTM 5，美国BioTek公司）;红外荧光扫描成像系统（ODYSSEY CLx，美国LI-COR公司）。
2 方法
2.1 细胞培养
使用含有10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、0.1 g/L链霉素的RPMI-1640培养基培养CNE2细胞，置于37 ℃、5% CO2及湿度饱和的培养箱中培养，适时换液，每2～3 d传代1次。
2.2 实时无标记细胞功能分析仪（RTCA）监测细胞增殖
取3块RTCA检测专用E-plate板，每孔各加入50 μL培养基，置于仪器中测量基线、平衡仪器。取对数生长期的CNE2细胞，37 ℃胰酶消化2 min，制成单细胞悬液，将细胞混匀后接种于E-plate板中，每孔100 μL细胞悬液，控制细胞密度为5 000个/孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每组设5个复孔。实验分组：每个药物分别设对照组和1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L共7组。接种后培养约12 h，细胞贴壁生长，弃去原培养液，每孔加入200 μL含药培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，RTCA持续监测72 h以上[7-8]。RTCA监测系统可通过自动计算细胞指数（cell index， CI）反映细胞增殖情况，CI=（Rn-Rb）/15，其中，Rn表示孔接种细胞后的电极阻抗值，Rb为背景阻抗基线值，进而绘制出细胞生长曲线。根据加药后24、36、48、60、72 h的均一化细胞指数，计算药物相对增殖率，增殖率=（实验组均一化细胞指数/对照组均一化细胞指数）×100%。
2.3 CytationTM 5多功能细胞成像微孔板检测系统监测细胞形态
取对数生长期的CNE2细胞，37 ℃胰酶消化2 min，制成单细胞悬液，每孔100 μL细胞悬液接种于96孔培养板中，控制细胞密度为5 000个/孔，细胞贴壁生长，弃去原培养液，每孔加入200 μL含药培养基或含溶剂培养基，实验分组：对照组、异欧前胡素组、阿魏酸组、绿原酸组，药物组浓度均为20 μmol/L。将96孔板放置于CytationTM 5检测系统中37 ℃、5% CO2继续培养48 h，设定每6 h进行一次全板自动圖像捕获及分析细胞形态图像，监测细胞生长形态。
2.4 Western blot检测蛋白表达
取对数生长期的CNE2细胞，传代至细胞培养皿中，细胞贴壁生长后弃去原培养液，加入含药培养基或含溶剂培养基，实验分组同“2.3”，置于37 ℃、5% CO2继续培养36 h后提取总蛋白并进行BCA定量，取50 μg蛋白配置上样体系。根据检测蛋白分子量配置合适浓度的分离胶和浓缩胶，上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭。按照一定稀释比例稀释β-actin、PCNA、XIAP和Survivin，4 ℃过夜孵育，TBST洗涤3次，每次10 min，再加入相对应的鼠二抗或兔二抗，室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，于ODYSSEY CLx红外荧光扫描成像系统上扫描显影，检测不同处理组间目的条带的信号值，计算相对表达量。
2.5 统计学分析
所有实验数据均采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，使用GraphPad Prism 8软件进行统计图的绘制，实验数据均采用“x±s”表示。两组间数据比较使用独立样本T检验方法。各组间计量资料数据比较使用单因素方差分析方法分析，方差齐使用
LSD检验进行多重比较，方差不齐使用DunnettT3多重检验。
3 结果
3.1 益气解毒方中苯丙素类化合物对CNE2细胞增殖的影响
异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸均能不同程度地抑制CNE2细胞增殖，呈现出药物浓度越高抑制效应越明显的趋势，同一药物作用时间点，3种中药单体的半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）不同。药物作用36 h后异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸的IC50分别为33.05、87.07、33.88 μmol/L。且这3种苯丙素类化合物抑制率出现明显拐点均出现在加药后36 h左右。见表1和图1-3。
3.2 益气解毒方中苯丙素类化合物对CNE2细胞形态的影响
与对照组饱满均匀，细胞结构完整的CNE2细胞形态相比，异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸处理后的大量细胞出现细胞膜破溃，细胞结构模糊等形态变化。与对照组相比异欧前胡素、阿魏酸处理的CNE2细胞抑制增殖的效应更显著，加药处理36 h后细胞增殖速度减慢并伴有大量细胞脱壁漂浮，细胞核固缩碎裂变形，胞内容物外翻等形态变化，绿原酸则是加药处理48 h后出现明显形态变化。见图4。
3.3 益气解毒方中苯丙素类化合物对CNE2细胞增殖相关蛋白的影响
与对照组相比，加药组的细胞增殖相关蛋白PCNA及细胞生存蛋白Survivin、凋亡抑制蛋白XIAP表达量均不同程度的降低，且差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见图5。
4 讨论
NPC的发生发展是一个多步骤、多因素的过程，发病机制复杂，包括EB病毒（epstein-barr virus， EBV）感染[9]、人乳头瘤病毒感染[10-11]、遗传易感性[12]等。NPC患者的早诊断早治疗，提高晚期NPC患者的生存率及改善其生活质量仍是NPC研究学者们关注的主要问题。已有大量前期研究[13-17]围绕益气解毒方对NPC细胞增殖、凋亡、自噬、迁移的作用和机制，益气解毒方由黄芪、党参、黄连、天花粉、白花蛇舌草、茯苓、甘草组成，体外能通过下调端粒酶的活性抑制细胞生长和诱导细胞凋亡，还可能通过抑制细胞内重要的核转录因子、细胞分裂增殖、细胞周期、DNA修复和诱导细胞凋亡、促进坏死等信号通路，从而抑制细胞增殖和诱导细胞死亡，体内可抑制裸鼠NPC移植瘤的形成等[8，18-19]。
益气解毒方中主要含有三萜类化合物和苯丙素类化合物，如槲皮黄素、山柰酚、芒柄花黄素、黄连素、茯苓酸、黄芪甲苷、异欧前胡素、绿原酸、熊果酸、齐墩果酸、汉黄芩素、小檗碱、阿魏酸等成分[20]。课题组前期研究[21]发现益气解毒方中三萜类化合物齐墩果酸、熊果酸、黄芪甲苷及茯苓酸对NPC CNE2细胞增殖效应的作用，证实其可以抑制CNE2细胞增殖。本研究主要比较益气解毒方苯丙素类化合物。异欧前胡素对多种肿瘤细胞株具有抑增殖促凋亡效应[3-4]。阿魏酸可通过抑制肿瘤细胞能量代谢、发挥直接细胞毒作用、诱导细胞凋亡等起到抗癌作用[22]。同样有大量研究发现绿原酸可在多种肿瘤中发挥抑制作用[5，23-24]。为了进一步探讨益气解毒方中苯丙素类化合物是否抑制了NPC CNE2细胞的增殖，三者之间效应有何不同，本研究通过监测细胞增殖曲线、形态改变及增殖相关蛋白质水平表达差异等方式进行研究。
RTCA通过监测E-plate板孔内电阻抗变化，分析得出的CI可以揭示细胞增殖、死亡、迁移等行为，有利于精确指导和改进实验设计。CytationTM 5多功能细胞成像微孔板检测系统可实时监测细胞形态并拍照记录，对活细胞进行动态监测与多维分析。PCNA是一个重要的细胞增殖相关蛋白，其可以在复制叉处协调大部分代谢反应，包括DNA复制和DNA修复等，还可以通过表皮生长因子受体（EGFR）在酪氨酸211（Y211）上的磷酸化修饰，PCNA过度表达及活化与多种癌症发生发展有关[25]。凋亡抑制因子XIAP和细胞生存蛋白Survivin均可介导细胞增殖。本实验通过RTCA监测发现异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸均能不同程度地抑制CNE2细胞增殖，并且呈现出药物浓度越高抑制效应越明显的趋势，不同药物单体发挥最佳药效的时间不同，3种苯丙素类化合物抑制率出现明显拐点均出现在加药后36 h左右。药物作用36 h后异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸的IC50分别为33.05、87.07、33.88 μmol/L。CytationTM 5实时监测结果显示，对照组CNE2细胞形态饱满均匀，细胞结构完整，异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸处理后的大量细胞出现细胞膜破溃，细胞结构模糊，细胞脱壁漂浮等形态异常变化。与对照组相比，加药组的PCNA、XIAP及Survivin蛋白表达均下调，且差異具有统计学意义（P<0.05）。
综上，本研究表明，益气解毒方中苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸可以抑制人NPC CNE2细胞增殖。异欧前胡素抑制增殖效应出现较慢，但出现形态异常时间较早，且抑制增殖效应较明显;绿原酸虽出现抑制增殖效应较早，抑制增殖效应较弱一些;阿魏酸抑制增殖效应及出现形态异常较早，但抑制增殖效应为三者中最弱。3种苯丙素类化合物均可损伤NPC CNE2细胞，使其细胞形态发生改变。异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸抑制NPC CNE2细胞增殖作用可能通过下调PCNA、XIAP及Survivin表达来完成。本研究对益气解毒方中苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸抑制NPC CNE2细胞增殖效应情况进行比较，并且对其机制进行初步研究，揭示益气解毒方的药效物质基础，明确益气解毒方单体有效作用成分，丰富益气解毒方应用于临床的科学理论依据，更好的指导临床用药。今后的实验将探索益气解毒方内主要苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸抑制NPC CNE2细胞增殖的更多分子机制。
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