汪富林?夏凯?冯鑫?庄锦涛?周明宽?廖武源?雷振明?项鹏?邓春华?涂响安
【摘要】目的 探討黄体生成素受体（LHCGR）对睾丸间质干细胞（SLC）增殖及分化能力的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及免疫荧光染色比较LHCGR-/-小鼠与LHCGR+/+小鼠睾丸内SLC标志物的表达情况。通过流式细胞术分选出SLC，进行5-乙炔基-2"-脱氧尿苷（EdU）及CCK-8增殖实验。同时诱导SLC向睾丸间质细胞（LC）分化，14 d后检测上清液睾酮水平。qRT-PCR及免疫荧光检测诱导分化后LC标志物表达水平。结果 LHCGR-/-小鼠睾丸内存在SLC，应用CD51标记并通过流式分选可获得SLC。LHCGR-/-小鼠SLC EdU+细胞比例和CCK-8增殖曲线与LHCGR+/+小鼠比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。LHCGR-/-小鼠SLC诱导分化后培养基上清液睾酮平均水平仅为0.01 ng/ml，低于LHCGR+/+对照组的2.71 ng/ml
（P < 0.001），其诱导分化后细胞LC标记物的表达也低于LHCGR+/+小鼠（P均< 0.001）。结论 敲除LHCGR基因后，睾丸内存在SLC且能维持正常的增殖活性，但是分化为LC受阻。
【关键词】黄体生成素受体;睾丸间质干细胞;增殖分化;睾丸间质细胞发育不良
Effect of luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor on the proliferation and differentiation of stem Leydig cells Wang Fulin， Xia Kai， Feng Xin， Zhuang Jintao， Zhou Mingkuan， Liao Wuyuan， Lei
Zhenming， Xiang Peng， Deng Chunhua， Tu Xiangan. Department of Urology and Andrology， the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China
Corresponding author， Tu Xiangan， E-mail：
tuxiangan@ mail. sysu. edu. cn
【Abstract】Objective To evaluate the effect of luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor （LHCGR） on the proliferation and differentiation of stem Leydig cells （SLCs）. Methods The expression levels of SLC markers in the testes between the LHCGR-/- and LHCGR+/+ mice were statistically compared by quantitative RT-PCR （qRT-PCR） and immunofluorescent staining. The CD51+ SLCs were sorted by flow cytometry and then subject to 5-ethynyl-2-deoxyuridine （EdU） and CCK8 assay. The SLCs were induced to differentiate into the testicular Leydig cells （LCs）. The testosterone level in the supernatant was detected after 14 d. The expression levels of LC markers after induced differentiation were quantitatively measured by qRT-PCR and immunofluorescent staining. Results SLCs were found in the testis of LHCGR-/- mice and these cells could be sorted by CD51 labeling and flow cytometry. The proportion of EdU+ cells and CCK-8 proliferation curve did not significantly differ between the LHCGR-/- and LHCGR+/+ SLCs （both P > 0.05）. After the induced differentiation of LHCGR-/- SLCs， the average testosterone concentration in the culture supernatant was 0.01 ng/ml， significantly lower than 2.71 ng/ml in the LHCGR+/+ mice （P < 0.001）. The expression levels of LC markers in the LHCGR-/- mice were significantly lower compared with those in the LHCGR+/+ mice （all P < 0.001）. Conclusion After LHCGR knockout， SLCs exist in the testis of LHCGR-/- mice and maintain normal proliferative activity. Nevertheless， the differentiation from SLCs into LCs is suppressed.
【Key words】Luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor;Stem Leydig cell;
Proliferation and differentiation;Leydig cell hypoplasia
黄体生成素受体（LHCGR）失活型突变是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病。男性患者可表现为小阴茎，尿道下裂甚至外生殖器完全女性化，严重影响男性性征发育、损害男性生育功能，给患者及家庭带来严重的心理负担[1]。其主要的发病机制是LHCGR失活引起睾丸间质细胞（LC）发育不良，导致睾酮合成不足，继而引起生精阻滞[2]。目前临床上睾酮替代疗法对生育力的改善极其有限，而且长期激素替代会抑制精子产生[3-4]。针对该类患者，迫切需要新疗法以恢复睾酮水平及重建生育力。
睾丸间质干细胞（SLC）是LC的前体细胞，能够通过增殖及分化过程转变为LC[5]。笔者团队所进行的前期研究显示，自体SLC移植能够恢复老年食蟹猴的睾酮水平、促进精子发生，是睾酮缺乏相关疾病的理想治疗方法[6]。另一方面，干细胞介导的基因修复在治疗基因突变型疾病中发挥重要作用，如基因编辑后造血干细胞移植已经被欧盟批准用于治疗β-珠蛋白生成障碍性贫血以及重症联合免疫缺陷病[7-8]。上述研究提示，经基因修复自体的SLC可能是治疗LHCGR缺陷疾病的理想的种子细胞;但是LHCGR基因突变后，睾丸内是否存在SLC及其增殖和分化能力如何，笔者尚未见有相关报道。因此，本研究探究LHCGR敲除后，小鼠睾丸内SLC数量和增殖分化能力的变化，以探讨自体SLC移植治疗该类患者的可行性。
材料与方法
一、实验动物
LHCGR+/-小鼠由雷振明教授惠赠，由LHCGR+/-小鼠繁育得到LHCGR-/-以及LHCGR+/+小鼠。分别选用7 ～ 14 d龄、体质量（5±2）g的LHCGR-/-以及LHCGR+/+雄性小鼠各10只;21 d龄（青春期）且体质量（10±2）g、56 d龄（成年期）且体质量（22±2）g的LHCGR-/-以及LHCGR+/+雄性小鼠各5只[9]。小鼠饲养在12 h光照/黑暗交替、温度22～24 ℃、湿度50%～70%的SPF级饲养环境，自由采食、饮水。本实验动物处理均符合中山大学附属第一医院伦理规范，动物伦理审批号为2020-003。
二、主要试剂
包括：TritonX-100（Sigma-Aldrich公司），DMEM/ F12培养基、牛血清白蛋白（BSA）、DAPI、防荧光淬灭剂（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），4%多聚甲醛（Phygene公司），OCT冷冻包埋剂（Sakura公司）;鼠抗Nestin（Arigo公司），兔抗血小板源性生长因子α（PDGFRα，Abcam公司），兔抗类固醇生成因子-1（SF-1）、鼠抗LHCGR（Novusbio公司），兔抗类固醇激素合成急性调节蛋白（STAR）、兔抗胰岛素样因子3（INSL3，Cell signaling Technology公司），鼠抗CD51-PE（R&D公司），羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG（Invitrogen公司）。
三、方 法
1. 小鼠SLC原代细胞的分离及培养
无菌条件下分离小鼠双侧睾丸，剥离睾丸白膜，加入消化液，置于37 ℃摇床中以100转/分消化15 min，然后用DMEM/F12终止消化，过滤，1100转/分离心4 min，弃上清。使用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并经滤网过滤后，1100转/分离心4 min，弃上清。加入适量的1%BSA重悬细胞，分为染色组及同型对照组;染色组中按照1∶50的比例加入鼠抗CD51-PE，对照组加入相应的同型对照，常温避光孵育20 min，加入PBS洗涤多余的抗体，1100转/分离心4 min，弃上清。将细胞沉淀用PBS重悬至流式上样管中，通过MoFloAstrios EQs流式细胞分选仪获得SLC，SLC于前述报道SLC培养基中培养[10]。分选获得的细胞记为P0，以后每传一代细胞记为Pn。
2. 免疫荧光染色
使用LHCGR-/-以及同窝的LHCGR+/+雄性小鼠睾丸，置于4%多聚甲醛中浸泡2 h，换高糖（30%）浸泡过夜，然后用OCT包埋睾丸，冰切机切成10 μm厚组织于载玻片上。组织染色时取组织切片于56 ℃烤箱中孵育15 min后，用PBS洗3次。0.2%Triton穿透15 min后，PBS洗1遍，10%山羊血清、2%BSA于PBS中封閉45 min，加一抗孵育过夜;PBS洗5次，加相应的二抗孵育45 min后，PBS洗5次。滴加DAPI，PBS洗2次。使用防荧光淬灭剂封片。用LSM800或Leica DMi8拍照。细胞染色时，取培养好的细胞，PBS清洗1次;甲醛固定15 min后PBS洗2次。0.2%Triton穿透
15 min，后续步骤同组织切片染色。
3. 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
为了探究LHCGR敲除之后，睾丸内是否还存在SLC。首先通过qRT-PCR检测了青春期及成年期小鼠睾丸组织SLC标记物CD51、巢蛋白（Nestin）、PDGFRα以及无芒相关同源异型盒基因（ARX）的表达水平[5， 11-14]。从睾丸组织或细胞中抽提RNA。RNA浓度及纯度由紫外分光光度计（NanoDrop 1000）测定。使用模板DNA合成试剂盒（Novoprotein）进行逆转录。PCR程序按照厂家推荐的方案进行，使用罗氏LightCycle 480 qRT-PCR仪检测。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物合成序列见表1。以β-actin为内参，根据△Ct计算靶基因表达水平，并以相对表达量的形式报告结果。每组测量3个样品，每个样品均重复测量3次后取平均值。
4. 睾丸SLC增殖能力检测
取P2代的LHCGR-/-及LHCGR+/+小鼠SLC用于增殖实验。5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）增殖实验具体步骤为：将P2代SLC消化之后，种植于24孔板中，种植密度为105个/孔。培养箱中过夜后，用培养基将EdU稀释至2倍工作液，半量换液加入到孔中2 h后染色，染色按照试剂盒说明书步骤进行。用Leica DMi8显微镜进行拍照，每组设8孔，每孔随机取3个视野计算EdU+细胞比例平均值。细胞CCK-8实验按标准操作程序进行：将细胞种植在96孔板中，种植细胞量为2×103
个/孔。待细胞贴壁后，连续5 d用Infinite F200 Pro酶标仪检测吸光度并记录。每组设20孔，重复测量3次吸光度值后取平均值。
5. 睾丸SLC分化能力检测
睾丸SLC分化液的配制和先前报道的类似[15]。具体为：DMEM/F12培养基中加入2%胎牛血清、10 ng/ml黄体生成素（LH）、1 nmol/L甲状腺激素、1 ng/ml白血病抑制因子、10 ng/ml血小板源性生长因子AA、50 ng/ml胰岛素样生长因子1和1%胰岛素-转铁蛋白-硒。将P2代SLC传至6孔板，待细胞长至50%左右时，半换液加诱导分化培养基。每2 d换液，诱导14 d后，取24 h上清液用化学发光法检测睾酮（金域公司），每组测量6孔。诱导分化后细胞qRT-PCR及免疫荧光检测如前所述。每组测量3个样品，每个样品均重复测量3次后取平均值。
四、统计学处理
利用GraphPad Prism 8.2.1制图，使用SPSS 25.0分析数据。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验，重复测量资料采用重复测量方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、LHCGR-/-小鼠睾丸内存在SLC
qRT-PCR检测结果显示，青春期LHCGR-/-小鼠SLC标记物表达水平与LHCGR+/+小鼠比较差异无统计学意义（CD51 t = 0.392、P = 0.714，Nestin t = 0.009、P = 0.993，PDGFRα t = 0.594、P = 0.584，ARX t = 1.185、P = 0.301），见图1A。成年期LHCGR-/-小鼠睾丸内SLC数量比青春期时减少，但LHCGR-/-小鼠SLC标记物ARX、Nestin表达高于LHCGR+/+小鼠（ARX t = 3.196、P = 0.033，Nestin t = 3.947、P = 0.017），CD51、PDGFRα表达呈升高趋势但组间比较差异无统计学意义（CD51 t = 2.326、P = 0.081，PDGFRα t = 1.968、P = 0.120），见图1A。免疫荧光检测结果显示，无论是青春期还是成年期的 LHCGR-/-小鼠，SLC标记物Nestin和PDGFRα的表达均高于LHCGR+/+小鼠（青春期Nestin t = 9.865、P < 0.001，PDGFRα t = 14.640、P < 0.001;成年期Nestin t = 21.170、
P < 0.001，PDGFRα t = 4.176、P = 0.006），见图1B～E。
二、LHCGR-/-小鼠SLC的分离及鉴定
通过用SLC特异性标记物CD51的流式抗体，从LHCGR-/-小鼠中分离出一群CD51+的细胞，见图2A;分选下来的细胞在镜下呈典型的长梭形的干细胞形态，见图2B。进一步对SLC的纯度进行了鉴定。通过细胞免疫荧光检测Nestin、PDGFRα的表达，发现99.0%的CD51+细胞表达Nestin，93.1%的CD51+细胞表达PDGFRα，进一步证实了LHCGR-/-小鼠分选获得的细胞为高纯度的SLC，见图2C、D。
三、LHCGR-/-小鼠SLC的增殖能力分析
P2代LHCGR-/-小鼠SLC与EdU共孵育2 h后，其EdU+细胞比例为14.57%;与LHCGR+/+小鼠（阳性细胞比例为14.63%）比较差异无统计学意义（t = 0.025，P = 0.980），见图3A、B。SLC与CCK-8共孵育1 h后，2组SLC的吸光度值均随时间升高，且LHCGR-/-小鼠与LHCGR+/+小鼠CCK-8增殖曲线比较差异无统计学意义（F处理=0.331，P = 0.569;F时间=33.015，P < 0.001;F交互=0.143，P = 0.966），见图3C。
四、LHCGR-/-小鼠SLC分化成LC受阻
使用诱导分化培养基诱导小鼠SLC分化后14 d，LHCGR+/+小鼠细胞培养基中睾酮平均水平达2.71 ng/ml，与之相对应的分化后LHCGR-/-小鼠细胞培养基中睾酮平均水平仅为0.01 ng/ml （t = 6.768，P < 0.001），提示LHCGR-/-小鼠SLC不能分化为具有产睾酮能力的LC，见图4A。qRT-PCR检测结果显示，LHCGR-/-小鼠SLC经过诱导后LC标记物STAR、SF-1、INSL3的mRNA表达低于LHCGR+/+小鼠（STAR t = 26.847、P < 0.001，SF-1 t = 36.956、P < 0.001，INSL3 t = 27.823，P < 0.001），見图4B。免疫荧光染色检测结果显示，LHCGR-/-小鼠SLC诱导分化后不表达LHCGR、STAR、SF-1、INSL3等LC标志蛋白，进一步提示LHCGR-/-小鼠SLC分化受阻，见图4C。
讨论
人LHCGR位于2号染色体短臂上，具有12个外显子，其编码的蛋白是具有7次跨膜结构的G蛋白耦联受体。LHCGR失活型突变是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病。目前已有多例报道LHCGR失活型突变引起的男性性腺发育不良[16-18]。其主要的发病机制是LC发育不良导致睾酮合成不足[2]。Lei等（2004年）利用超生理剂量（4 ～ 8倍生理剂量）的睾酮可以部分重建LHCGR-/-小鼠生育力。但是超生理剂量的睾酮会引起睾丸变小、抑制生精、情绪改变、头痛等不良反应，无法应用于临床[3]。SLC是LC的前体细胞，研究发现SLC移植能恢复衰老以及损伤引起的睾酮低下小鼠模型的睾酮水平[6]。Lo等（2004年）也发现睾丸侧群细胞移植可以恢复LHCGR-/-小鼠的睾酮水平以及改善生精功能。但是异体的SLC移植可能会引起免疫排斥，阻碍细胞疗法的临床转化。笔者前期研究发现，自体SLC移植可恢复衰老食蟹猴的睾酮水平，减轻睾酮缺乏相关症状[6]。因此针对LHCGR失活型突变来说，自体SLC移植可能是潜在的解决方案。而LHCGR失活型突变个体中是否存在SLC及其增殖和分化能力如何，笔者尚未见有相关报道。
本研究通过检测睾丸内SLC标记物mRNA及蛋白的表达，结果显示LHCGR-/-小鼠睾丸内存在SLC，且与LHCGR+/+小鼠相比，成年时睾丸中SLC比例更高，这可能与生精细胞比例较低有关。本研究进一步根据既往文献使用CD51作为标志物，通过流式细胞分选技术获得了SLC[19]。结果显示，原代SLC呈典型的长梭形的干细胞形态。尽管Chen等[20]报道成年小鼠CD51强阳性的细胞为巨噬细胞，但是本研究分离获得SLC的小鼠日龄为7 ～ 14 d，相对而言，巨噬细胞含量较少，流式细胞分选也并未看到明显的分群。另外，本研究的免疫荧光染色结果显示，99.0%的CD51+的细胞表达SLC标记物Nestin，进一步提示分选后细胞为高纯度的SLC。
增殖和分化是干細胞最重要的特性。本研究显示，LHCGR-/-小鼠SLC具有正常的增殖能力，但是不能分化为具有产睾酮能力的LC，提示LHCGR失活型突变会引起SLC分化受阻。与之相对应地，文献报道LHCGR-/-小鼠和LHCGR失活型突变患者睾丸内仅有极少数发育不良的睾丸间质细胞[9]。但是目前尚不清楚LHCGR突变之后引起SLC分化受阻的原因。可能与SLC细胞分化需要LH的刺激，而LHCGR突变之后，细胞丧失了对LH的反应性有关。LH作用于LHCGR可激活下游信号分子环磷酸腺苷，因此直接的环磷酸腺苷刺激能否促进LHCGR-/-小鼠SLC分化仍待进一步研究阐明。
总之，LHCGR基因敲除小鼠睾丸内存在SLC，且能使用CD51标记细胞通过流式分选出该群细胞。该类小鼠的SLC增殖能力正常，但是不能分化为具有产睾酮能力的LC。提示直接的SLC自体移植可能不适用于该类患者，文献报道LHCGR突变往往是由点突变引起，通过基因编辑体外修复SLC后移植可能是该类疾病的解决方案[21]。
参 考 文 献
[1] Wisniewski AB， Batista RL， Costa EMF， Finlayson C， Sircili MHP， Dénes FT， Domenice S， Mendonca BB. Management of 46，XY differences/disorders of sex development （DSD） throughout life. Endocr Rev，2019，40（6）：1547-1572.
[2] Teerds KJ， Huhtaniemi IT. Morphological and functional maturation of Leydig cells：
from rodent models to primates. Hum Reprod Update， 2015， 21（3）：310-328.
[3] Halpern JA， Brannigan RE. Testosterone deficiency. JAMA， 2019， 322（11）：1116.
[4] 罗道升，邓春华. 迟发性性腺功能低下的研究进展. 新医学， 2007， 38（12）：821-822.
[5] Jiang MH， Cai B， Tuo Y， Wang J， Zang ZJ， Tu X， Gao Y， Su Z， Li W， Li G， Zhang M， Jiao J， Wan Z， Deng C， Lahn BT， Xiang AP. Characterization of Nestin-positive stem Leydig cells as a potential source for the treatment of testicular Leydig cell dysfunction. Cell Res， 2014， 24（12）：1466-1485.
[6] Xia K， Chen H， Wang J， Feng X， Gao Y， Wang Y， Deng R， Wu C， Luo P， Zhang M， Wang C， Zhang Y， Zhang Y， Liu G， Tu X， Sun X， Li W， Ke Q， Deng C， Xiang AP. Restorative functions of autologous stem leydig cell transplantation in a testosterone-deficient non-human primate model. Theranostics， 2020， 10（19）：8705-8720.
[7] Aiuti A， Roncarolo MG， Naldini L. Gene therapy for ADA-SCID， the first marketing approval of an ex vivo gene therapy in Europe：
paving the road for the next generation of advanced therapy medicinal products. EMBO Mol Med， 2017， 9（6）：737-740.
[8] Schuessler-Lenz M， Enzmann H， Vamvakas S. Regulators advice can make a difference：
european medicines agency approval of zynteglo for beta thalassemia. Clin Pharmacol Ther， 2020， 107（3）：492-494.
[9] Lei ZM， Mishra S， Zou W， Xu B， Foltz M， Li X， Rao CV. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Mol Endocrinol， 2001， 15（1）：184-200.
[10] Feng X， Xia K， Ke Q， Deng R， Zhuang J， Wan Z， Luo P， Wang F， Zang Z， Sun X， Xiang AP， Tu X， Gao Y， Deng C. Transplantation of encapsulated human Leydig-like cells：
a novel option for the treatment of testosterone deficiency. Mol Cell Endocrinol， 2021， 519：111039.
[11] Guan X， Chen P， Zhao X， Hao X， Chen F， Ji M， Wen X， Lin H， Ye L， Chen H. Characterization of stem cells associated with seminiferous tubule of adult rat testis for their potential to form Leydig cells. Stem Cell Res， 2019， 41：101593.
[12] Stanley E， Lin CY， Jin S， Liu J， Sottas CM， Ge R， Zirkin BR， Chen H. Identification， proliferation， and differentiation of adult Leydig stem cells. Endocrinology， 2012， 153（10）：5002-5010.
[13] Miyabayashi K， Katoh-Fukui Y， Ogawa H， Baba T， Shima Y， Sugiyama N， Kitamura K， Morohashi K. Aristaless related homeobox gene， Arx， is implicated in mouse fetal Leydig cell differentiation possibly through expressing in the progenitor cells. PLoS One， 2013， 8（6）：e68050.
[14] Ge RS， Dong Q， Sottas CM， Papadopoulos V， Zirkin BR， Hardy MP. In search of rat stem Leydig cells：
identification， isolation， and lineage-specific development. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006， 103（8）：2719-2724.
[15] Xia K， Ma Y， Feng X， Deng R， Ke Q， Xiang AP， Deng C. Endosialin defines human stem Leydig cells with regenerative potential. Hum Reprod， 2020， 35（10）：2197-2212.
[16] Aktar Karakaya A， Unal E， Be?ta? A， Ta? F， Onay H， Haspolat YK. A novel variant in LCHGR gene in 3 siblings with type 1 Leydig cell hypoplasia. Gynecol Endocrinol， 2020， 36（12）：1136-1139.
[17] Hassan HA， Essawi ML， Mekkawy MK， Mazen I. Novel mutations of the LHCGR gene in two families with 46，XY DSD causing Leydig cell hypoplasia I. Hormones （Athens）， 2020 ， 19（4）：573-579.
[18] Yu BQ， Liu ZX， Gao YJ， Wang X， Mao JF， Nie M， Wu XY. Prevalence of gene mutations in a Chinese 46，XY disorders of sex development cohort detected by targeted next-generation sequencing. Asian J Androl， 2021， 23（1）：69-73.
[19] Zang ZJ， Wang J， Chen Z， Zhang Y， Gao Y， Su Z， Tuo Y， Liao Y， Zhang M， Yuan Q， Deng C， Jiang MH， Xiang AP. Transplantation of CD51+ stem leydig cells：
a new strategy for the treatment of testosterone deficiency. Stem Cells， 2017， 35（5）：1222-1232.
[20] Chen P， Guan X， Zhao X， Chen F， Yang J， Wang Y， Hu Y， Lian Q， Chen H. Characterization and differentiation of CD51+ stem leydig cells in adult mouse testes. Mol Cell Endocrinol， 2019， 493：110449.
[21] Qiao J， Han B. Diseases caused by mutations in luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor. Prog Mol Biol Transl Sci， 2019，161：69-89.
（收稿日期：2021-03-08）
（本文編辑：林燕薇）
