摘 要 目的：探讨兰尼碱受体2（ryanodine receptor 2， RyR2）在浸润性乳腺癌组织中的表达及其临床病理学意义。方法：使用聚合酶链式反应、蛋白质印迹、免疫组织化学染色等方法检测RyR2在浸润性乳腺癌患者乳腺癌、乳腺癌旁和正常乳腺组织样本中的表达水平，并分析其与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移和超声检查特征间的关系。结果和结论：RyR2在浸润性乳腺癌组织中的表达水平显著低于乳腺癌旁和正常乳腺组织（均P<0.01），且其在浸润性乳腺癌组织中的低表达与乳腺癌的组织学分级高、雌激素受体阴性、存在微钙化和淋巴结转移相关（均P<0.05）。结合超声检查和RyR2检测结果能为浸润性乳腺癌的诊断提供更准确的判读结果。
关键词 兰尼碱受体2 浸润性乳腺癌 超声检查
中图分类号：R737.9；
R446 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2022）07-0062-04
引用本文 李腊梅. 兰尼碱受体2在浸润性乳腺癌组织中的表达及其临床病理学意义[J]. 上海医药， 2022， 43（7）：
62-65.
Expression of ryanodine receptor 2 in invasive breast cancer tissues and its clinicopathological significance
LI Lamei
（Department of Pathology， the Seventh People’s Hospital of Zhengzhou， Zhengzhou 450016， China）
ABSTRACT Objective：
To investigate the expression of ryanodine receptor 2 （RyR2） in invasive breast cancer tissues and its clinicopathological significance. Methods：
RyR2 expression levels in breast， adjacent and normal breast tissue samples from patients with invasive breast cancer were determined using polymerase chain reaction， Western blotting， and immunohistochemical staining and their relationship with breast cancer histological grade， lymph node metastasis and ultrasonographic features was analyzed. Results & Conclusion：
The expression level of RyR2 in invasive breast cancer tissues was significantly lower than that in adjacent breast cancer tissues and normal breast tissues （all P<0.01）， and its low expression in invasive breast cancer tissues was associated with high histological grade of breast cancer， estrogen receptor negativity， microcalcification and lymph node metastasis （all P<0.05）. Combination of ultrasonography with RyR2 detection results can provide more accurate interpretation results for the diagnosis of invasive breast cancer.
KEy wORDS ryanodine receptor 2；
invasive breast cancer；
ultrasonography
乳腺癌是婦科常见肿瘤，严重威胁女性的健康和生命[1]。随着现代医学的发展，人们发现乳腺癌是多因素相互作用的结果，众多分子标志物均有助于乳腺癌的诊断[2-3]。超声检查目前已普遍用于乳腺癌的早期筛查及诊断[4]，且通过观察乳腺癌的超声征象并结合肿瘤相关蛋白表达状态可以预测乳腺癌患者的预后[5-6]。兰尼碱受体2（ryanodine receptor 2， RyR2）与肺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤的发生发展相关[7-8]，但其在乳腺癌组织中的表达和临床意义还未见有研究报告。本研究拟通过分析RyR2在浸润性乳腺癌组织中的表达及与患者肿瘤超声征象、雌激素受体（estrogen receptor， ER）状态等之间的相关性，为浸润性乳腺癌的诊断提供新的更加精准的依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
收集2016年1月—2020年12月来我院就诊并接受手术治疗的浸润性乳腺癌患者的肿瘤组织样本为研究对象，共收集到147例患者的浸润性乳腺癌组织样本、41例患者的浸润性乳腺癌旁组织样本，同时收集到21例乳腺癌患者的肿瘤远端正常乳腺组织样本。所有患者均经术前检查（包括超声检查）和术后免疫组织化学检查确诊为乳腺癌。所有患者均是首次接受手术治疗。
本研究的目的和方法已事先告知患者本人及家属，患者本人或其家属签署了知情同意书。本研究方案获得我院医学伦理委员会批准。
1.2 超声检查
对患者乳腺肿块，使用西门子S3000和日立图腾彩色多普勒超声诊断系统进行超声检查，探头频率8 ～ 12 MHz。记录患者乳腺肿块的大小、纵横比、边界、形态、微钙化、彩色血流、淋巴结转移和后方回声等数据。
1.3 免疫组织化学染色检查
将以常规石蜡包埋的组织样本切片，梯度洗脱，RyR2和ER抗体孵育，后续步骤严格按照试剂盒说明书进行。根据染色反应的阳性强度判断结果：阳性细胞数≤5%为0分，6% ～ 25%为1分，26% ～ 50%为2分，51% ～ 75%为3分，≥76%为4分。评分≥1分为RyR2阳性。
1.4 蛋白质印迹试验
对患者组织样本，严格按照试剂盒说明书提取组织蛋白，然后置冰上裂解30 min，低温离心处理30 min，吸取上清液，得总蛋白。紧接着蛋白定量，加入上样缓冲液，沸水煮5 min。进行蛋白电泳、转膜，转膜结束后用脱脂牛奶封闭，孵育一抗，冰箱4 ℃下过夜。次日清洗，孵育二抗，最后使用灰度扫描仪检测有无RyR2表达。有表达为RyR2阳性。
1.5 反转录聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction， RT-PCR）
对患者组织样本，严格按照试剂盒说明书进行组织RNA提取、定量、反转录和聚合酶链式反应。引物序列：RyR2，前序列ATTTTTCTGDCGACACCCGAT，反向序列TCCCAGGTGTAGACCAA；
甘油醛-3-磷酸脱氢酶，前序列ATTTTTGTACCACAATGC，反向序列TGACCGGTGTCCCTGACGAT。有表达为RyR2阳性。
1.6 统计学方法
对研究数据，使用SPSS 15.0软件进计统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Fisher最小显著差异检验；
计数资料采用频数和百分比表示，组间比较采用卡方检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 RyR2在不同乳腺组织中的表达
分别使用RT-PCR、免疫组织化学染色检查和蛋白质印迹试验检测了RyR2在不同乳腺组织中的表达情况，结果显示RyR2阳性率在147例患者的浸润性乳腺癌组织样本（肿瘤组）中为27.89%（41/147），在41例患者的浸润性乳腺癌旁组织样本（癌旁组）中为75.61%（31/41），在21例患者的正常乳腺组织样本（对照组）中为76.19%（16/21），即RyR2在浸润性乳腺癌组织中的表达水平显著低于浸润性乳腺癌旁组织和正常乳腺组织（图1，均P<0.001）。
2.2 RyR2表达与浸润性乳腺癌组织临床病理学特征的关系
RyR2阳性率在浸润性乳腺癌患者肿瘤组织样本中为27.89%（41/147），其中在ER阳性患者中为35.19%（38/108），在ER阴性患者中为7.69%（3/39），差异显著（χ2=10.769，P=0.001）；
在组织学分级Ⅰ ～ Ⅱ级患者中为32.20%（38/118），在组织学分级Ⅲ级患者中为10.34%（3/29），差异显著（χ2=5.530，P=0.019）；
在肿瘤TNM分期Ⅰ期患者中为11.76%（4/34），在肿瘤TNM分期Ⅱ～ Ⅲ期患者中为32.74%（37/113），差异显著（χ2=5.719，P=0.017）。
2.3 RyR2表达与浸润性乳腺癌组织超声征象的关系
分析RyR2表达与浸润性乳腺癌组织超声征象的关系发现，肿瘤组织的大小、形态、边界、纵横比、后方回声衰减和彩色血流信号与RyR2表达均没有相关性（均P>0.05），但在超声检查提示存在微钙化或腋窝淋巴结增大的肿瘤组织中，RyR2低表达（表1，均P<0.05）。
3 讨论
浸润性乳腺癌是妇科常见肿瘤。目前，乳腺癌的发病率越来越高，且发病年龄呈年轻化趋势，成为严重威胁女性生命健康的主要疾病之一。乳腺癌发生和发展的分子机制十分复杂，现尚不完全清楚，但随着分子生物学和生物技术的不断发展，越来越多的乳腺癌相关分子标志物被发现，并被用于乳腺癌的诊断和治疗中。
作为兰尼碱受体家族成员，RyR2参与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移，在这些肿瘤的发生发展和转移过程中起着重要作用[7-9]。本研究通过RT-PCR、免疫组织化学染色检查和蛋白质印迹试验检测了RyR2在浸润性乳腺癌组织、癌旁组织和正常乳腺组织中的表达情况，发现RyR2在浸润性乳腺癌组织中的阳性率远远低于浸润性乳腺癌旁组织和正常乳腺组织（阳性率分别为27.89%、75.61%和76.19%），提示RyR2可能具有抑制乳腺癌发生发展和维持正常乳腺组织的作用，有用作浸润性乳腺癌分子标志物的潜力。
本研究还分析了RyR2表达与浸润性乳腺癌组织超声征象的关系，发现肿瘤组织的大小、形态、边界、纵横比、后方回声衰减和彩色血流信号与RyR2表达均没有相关性，但在超声检查提示存在微钙化或腋窝淋巴结增大的肿瘤组织中，RyR2低表达。鉴于本研究免疫组织化学染色检查结果显示，在RyR2高表达样本中，ER也几乎高表达，故术前超声检查提示存在微钙化且RyR2低表达可能提示浸润性乳腺癌ER低表达。此外，RyR2在超声检查提示腋窝淋巴结增大的浸润性乳腺癌组织中低表达，这与免疫组织化学染色检查显示RyR2在腋窩淋巴结转移的浸润性乳腺癌组织中低表达的结果一致。结合RyR2表达情况和超声检查结果，可以更准确地预测浸润性乳腺癌的恶性程度和患者预后。
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