邱小忠 杨罡 陈俊 黄国昌 龚小华 连晨姿
摘 要 微生物可以用于提高农业生产效益，基于此，介绍和探讨饲料用植酸酶、固氮微生物肥料以及微生物农药的研究与开发，如微生物农药中细菌杀虫剂、真菌杀虫剂、病毒杀虫剂和杀虫抗生素等的最新研究进展。同时，建议加强微生物基因工程的基础研究，明确确定研究重点，为后续革新生产工艺，调整研发结构，促进产业发展奠定基础。
关键词 微生物;基因工程;农业产业化
中图分类号：F323.3 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.32.075
微生物与人类的关系十分密切，人们生活中的酒、面包、酸奶、抗生素和疫苗等都来源于微生物发酵。但与此同时，有害微生物也可能导致严重灾难，如黑死病、新冠病毒等。由于微生物的诸多作用，人们开始探索微生物作用于提高农业生产经济效益的各种可能，并结合基因工程放大这种效益和成果。
1 饲料用植酸酶的产业化
在动物肠道中，微生物起着促进消化的作用，控制禽畜肠道微生物平衡、改善禽畜肠道微生物种类能够使得被禽畜摄入的食物更快速地分解，有助于禽畜消化吸收食物中各种营养成分。植酸酶是可以由微生物产生并帮助禽畜消化吸收植酸磷的一种助剂，其不仅有着减少禽畜粪便磷污染的作用，还能够促进禽畜吸收分解后的无机磷，减少饲料中磷酸氢钙的使用，促使禽畜更好更快地生长。中国农业科学院饲料研究所结合微生物基因工程技术修饰改造了植酸酶基因phAc，研究出了高产植酸酶的毕赤酵母，重组后的毕赤酵母植酸酶产量是原始菌株的3 000倍[1]。该成果已经应用于禽畜养殖领域，年产植酸酶已经超过20万吨，利润高达17.35亿元。饲料用植酸酶产业化已经相对成熟，生产出的植酸酶在各个省市都有供应。
2 固氮微生物肥料的产业化
氮元素是植物生长并合成蛋白质不可或缺的必要元素，在植物种植领域，尿素的使用极大地提高了农作物产量，但尿素生产也会产生很大污染，且尿素生产成本较高，价格波动较大，减少尿素等化肥的使用一直是农业生产所追求方向。由于土壤中植物根系附近共生着许多固氮微生物，在非豆类植物固氮方面存在较大的研究价值。如北京大学等针对对固氮斯氏假单胞菌进行基因工程层面的研究，通过构建携带固氮挤压和耐铵基因的菌株实现了菌株固氮作用的提高，并在种植领域广泛应用[2]。该应用最先在辽宁省推广，使得辽宁省部分植物氮肥使用减少了15%，并增产10%以上。联合固氮微生物虽然比不上自身固氮微生物固氮效率高，但其还会产生吲哚乙酸、维生素、赤霉素、氨基酸等营养物质，同样具有促进植物生长发育的作用。
固氮菌肥料的生产应严格按照微生物要求在设备完善的工厂生产，通过原始生产菌种、一级扩大斜面菌种、二级扩大液体菌种、种子罐、发酵罐和分装出厂等流程完成生产工序。生产的固氮菌肥料主要有3种剂型：1）液体剂型，该剂型生产使用均十分便利，但在高温条件下菌株数量下降较快，适合随产随用，一般面向工厂周边的农业生产;2）固体剂型，一般以草炭等作为吸附剂载体，由于载体中含有大量有利于固氮菌生产的有机质，固体剂型中固氮菌还能再繁殖，适用于更远地区使用;3）冻干制剂型，冻干制剂通常是将发酵制成的菌液通过低温真空冻干技术制造成型，每瓶制剂可含活菌200亿个以上，该方法生产的制剂通过冷冻保存可以拥有更长的保质期，但生产成本更高。
除了固氮菌外，还有很多有助于植物生长的细菌，如醋杆菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌等，并衍生出植物根际促生菌肥，如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌能产生类赤霉素物质以及吲哚乙酸，还有些植物根际促生菌有抑制镰刀菌、腐霉菌等病菌的作用。这些植物根际促生菌与其他微生物肥料共同使用效果往往更好，但也需要注意是否会产生拮抗作用。
3 微生物农药的研究与开发
3.1 细菌杀虫剂
农药是农业中用于消灭病虫害、保证农作物正常生长的制剂，但农药不仅对害虫有效也可能因为食用而作用于人体，因此农药的使用开始被限制。在农药使用受限的背景下，研发对人体无害的非化学农药，微生物农药就是在这背景下产生的。微生物农药可分为两种，分别是利用微生物活体制成的农药和利用微生物的代谢产物制成的农药;亦可以根据用途划分为杀虫剂、杀菌剂以及除草剂。专门寄生于昆虫的病原菌有日本紧箍咒芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌等，可诱发金龟子幼虫发生乳状病，但这些菌种只在幼虫体内生长，培养难度较大。常用的芽孢杆菌主要是产伴孢晶体昆虫病原菌——苏云金芽孢杆菌，该昆虫病原菌对鳞翅目、直翅目、毛翅目等超过600种昆虫有致病作用，在杀虫领域被广泛使用和研究。在此基础上，华中农业大学、中山大学等独立发现了苏云金芽孢杆菌超过35个新基因型，并将超过10种的苏云金芽孢杆菌应用于棉花、蔬菜等的病虫害防治，如WG001就是我国首个成功商业化的苏云金芽孢杆菌菌剂[3]。苏云金芽孢杆菌制剂通常是通过人工生产培养后获取芽孢、伴孢晶体等有效杀虫毒素，然后制作成杀虫菌剂，生产方法有液体深层通气发酵法和固体发酵法两种，制剂类型有粉剂、颗粒剂和悬浮剂等多种。
3.2 真菌杀虫剂
除苏云金芽孢杆菌制作而成的细菌杀虫剂外，部分真菌同样具有杀虫效力。当前已知的以昆虫为寄主的真菌超过750种，涉及昆虫超过200种，如虫草菌是杀死昆虫产生冬虫夏草的一种真菌。但冬虫夏草生长周期较长，并不适合作为杀虫菌剂使用。关于杀虫真菌方面，相关研究较多主要为白僵菌和绿僵菌。白僵菌主要以分生孢子作为侵染手段，当分生孢子附着于昆虫体壁上时，在湿润条件下萌发孢子的芽管可以穿透昆蟲体壁吸收营养并在昆虫血腔中大量繁殖，最终导致昆虫死亡。白僵菌常用于玉米螟虫和松毛虫的防治。在我国开始大量种植玉米后，关于白僵菌的研究主要方向转为研制对玉米螟虫毒性更高的白僵菌。如吉林省农科院研制出Mad1基因球孢白僵菌工程菌株，通过克隆来源于生防真菌绿僵菌的黏着蛋白基因Mad1结合PEG介导原生质体转化法最终获得了转Mad1基因球孢白僵菌[4]。转Mad1基因球孢白僵菌对亚洲玉米螟幼虫致死时间缩短34.07%，具有较高的实用价值。白僵菌培养较为容易，通过麦麸、玉米粉等制半固体培养基即可培养得分芽孢，将培养物干燥即可得到白僵菌粉剂。
3.3 病毒杀虫剂
除细菌真菌外，病毒也可作为杀虫剂使用。当前已知能够作用于昆虫的病毒超过1 600种，其中研究和使用较多的是核多角体病毒（Nuclear Polyhedrosis Viruses，简称NPV），NPV病毒的特点是宿主特异高，杀虫范围窄，但不影响天敌也无污染，主要传播手段为宿主的繁殖行为，杀虫时间较长且适用虫谱较窄。关于NPV病毒的研究有很多，如薛贵收等对野生型斜纹夜蛾核型多角体病毒（SpltMNPV）日本株进行了改造，通过缺失polh或egt基因并插入由多角体启动子pph启动外源毒素蝎毒素基因，获得了杀虫效力更高的重组病毒[5]。由于NPV病毒生产不如细菌真菌便捷，且适用范围较窄，NPV商业化成功的案例还较少。
3.4 杀虫抗生素
杀虫抗生素也是常见的杀虫产品，杀虫抗生素主要由微生物次级代谢物为主要成分，这些次级代谢物对部分昆虫有毒害作用。杀虫抗生素种类很多，如抗霉素、杀蝶素、尼可霉素、杀螨素和密尔比菌素等。抗霉素对蝇类、蜘蛛等毒性很高，还有抑制真菌生长的作用，但由于其对人体同样有较高伤害因此未被广泛使用。当前广泛使用的杀虫抗生素主要是阿维菌素，其有阿维链霉菌产生，对线虫、节肢动物以及螨类都有非常高的杀虫活性。作用机理为抑制无脊椎动物的γ-氨基丁酸的激活剂使昆虫神经麻痹并最终死亡。浙江海正药业股份有限公司通过的破坏除虫链霉菌ave D基因，提高阿维菌素B1a的发酵单位，使得阿维菌素单位发酵产量提高了33.6%[6]。另外，多杀菌素也是一种重要的杀虫抗生素，其对小菜蛾、棉铃虫等常见害虫菌有效，适用于上百种农作物。关于多杀菌素的基因工程研究以提高多杀菌素产量为主，如黄颖等针对基于组学分析开展了构建多杀菌素高产基因工程菌及其代谢调控的研究[7]。
除了杀虫以外，微生物也可用于杀菌，如引起冠瘿病的土壤杆菌可以由放射土壤杆菌的拮抗作用来治理;木霉菌可以用于镰刀菌病害防治等。微生物杀菌同样可以以农药抗生素的方式进行，如井冈霉素、公主岭霉素等都是较好的杀菌抗生素。
4 微生物基因工程农业产业化发展建议
4.1 加强基础研究
关于微生物基因工程的研究一直在稳步推进，但大部分是对已有微生物已知基因功能的挖掘和利用，在DNA蛋白质层面的研究严重不足。科学家至今也只清楚部分DNA产生蛋白质后的作用，对于大部分微生物其他DNA的作用并不十分清楚。加强基础研究有助于更全面地了解微生物，更好地将微生物应用于生产生活的各个领域，并提高人们对细胞微生物等的了解。应加强农业微生物结构基因组和功能基因组学研究，加强微生物在除草、堆肥、沼气发酵、污水处理、土壤处理等领域的应用和研究，促使微生物研究与实用场景结合。
4.2 确定研究重点
多年来，人们高度重视对细菌真菌这两大种类微生物的研究，却忽视了病毒在微生物领域的特殊作用。事实上，SARS病毒、H5N1禽流感病毒、猪流感病毒乃至现在的新冠病毒多次给人类带来惨痛损失，关于病毒的研究却总是停留在测序、疫苗研制等有限领域，可见关于病毒的研究亟待加强。应重点关注病毒与细胞结合的特殊功能，探索病毒修复目标细胞基因缺陷的可能，探索通过病毒运输靶向药的可能，探索病毒为人类身体健康服务，为农业生产服务的可能。
4.3 革新生产工艺
当前，农业微生物产品主要以液态制剂、固态制剂以及冻干制剂3种，前两者虽然生产较为方便但都有较大的保存限制。革新生产工艺有助于微生物产品的保存和更广泛的应用，降低微生物产品的使用门槛，提高微生物基因工程研究的经济效益，革新生产工艺应以加速微生物培养以及提高产品纯度为主要研究方向。
4.4 调整研发结构
产学研一体化是值得借鉴的科研体系，引入企业的力量不仅有助于高校研究方向的确立，也有助于提高高校科研资金和实力。应尽可能多地与企业合作，如与生猪养殖企业合作研制非洲猪瘟病毒疫苗等，相关研究一旦有研究成果可以快速落地，加速科研成果产业化的落地速度。
5 结语
微生物产业化发展还有很多路要走，虽然在关于病虫害防治方面的研究已经有很多，但对于微生物在除草、土壤治理、污水处理等方面的研究依然不足。微生物研究也需要產学研一体化发展，提高研究的应用价值和产业配套速度，以更好地体现微生物研究的应用价值。
参考文献：
[1] 崔帅，王作平，于江辉，等.转植酸酶-抗菌肽融合基因水稻BPL9K的植酸酶活性分析[J].分子植物育种，2019，17（10）：3332-3339.
[2] 刘剑君，王豹祥，张朝辉，等.一株具有固氮功能的烟草根际微生物的鉴定及其初步效应[J].植物营养与肥料学报，2011，17（5）：1237-1242.
[3] 陆宴辉，赵紫华，蔡晓明，等.我国农业害虫综合防治研究进展[J].应用昆虫学报，2017，54（3）：349-363.
[4] 赵宇，张佳诗，刘艳微，等.创制转Mad1基因球孢白僵菌工程菌株提高对玉米螟毒力[J].玉米科学，2019，27（5）：39-44，51.
[5] 薛贵收，肖娱玉，朱江，等.昆虫杆状病毒杀虫剂的研究与应用进展[J].江苏农业科学，2009（2）：8-11.
[6] 李美红，李娜，王海彬，等.aveD基因失活提高阿维菌素工业菌株B组分产量[J].国外医药（抗生素分册），2014，35（5）：216-218，254.
[7] 黄颖，赵晨，杨博磊，等.刺糖多孢菌高产菌株和野生型菌株多杀菌素生物合成基因簇（spn）在发酵过程中的表达分析[J].农业生物技术学报，2014，22（11）：1337-1346.
（责任编辑：赵中正）
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