第九章 基因工程 学习目标 掌握：1．基因工程的概念。
2．基因工程的基本过程。
熟悉：1．基因工程常用工具酶 2．基因工程载体必备的条件和常用载体 了解：1．基因工程在科研和临床中的应用。
1973年，是Cohen等人首次将不同DNA分子在体外进行连接获得重组DNA分子，并在大肠杆菌中成功表达，由此开创了基因工程。此后，基因工程作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速发展。基因工程(genetic engineering)又称为分子克隆技术或重组DNA技术，是将目的DNA与具有自我复制能力的载体DNA连接形成重组DNA分子，然后将其导入受体细胞中进行复制或表达相关基因产物的过程。利用基因工程可以得到大量的目的DNA分子或目的基因的表达产物，并对其产物进行分析。在遗传病、心血管病、肿瘤等多种疾病的研究和治疗提供了新的方法和途径，它对生命科学的发展起到了不可估量的作用。
第一节 基因工程的工具酶 基因工程中需要对DNA分子进行切割、重新连接、修饰及合成等操作，这些过程中需要许多酶类来完成，主要有限制性核酸内切酶、外切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及反转录酶等。基因工程中常用的工具酶见表9-1。
表9-1基因工程中常用的工具酶 工 具 酶 主 要 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异核苷酸序列，切割DNA分子 DNA连接酶 催化DNA中相邻的5＇磷酸基和3＇羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封闭或使两个DNA分子连接 DNA聚合酶I 具有5＇→3＇的聚合酶活性、5＇→3＇的核酸外切酶活性和3＇→5’的核酸外切酶活性，用于合成双链DNA分子，制作DNA探针，DNA序列分析 BAL31核酸酶 具有单链特异的核酸内切酶活性，同时也具有双链特异的核酸外切酶活性 DNase I 在适当的条件下，能在双链DNA上随机地产生单链切口。用于缺口平移标记DNA探针、DNaseI足迹分析法鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点 碱性磷酸酶 切除核酸5＇末端磷酸基团，在重组DNA时防止线性化的载体分子发生自我连接 核酸外切酶III 从双链DNA的3＇羟基末端去除单核苷酸，使双链DNA分子产生单链区 T4多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5＇羟基末端磷酸化，常用来标记核酸分子的5＇末端，或使寡核苷酸磷酸化 末端转移酶 催化5＇脱氧核苷三磷酸按5＇→3＇方向进行聚合，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3＇羟基末端，用于在3＇羟基末端进行同聚物加尾 反转录酶 催化以RNA为模板合成DNA的反应，可合成CDNA、替代DNA聚合酶I进行填补、标记或DNA序列分析 Taq DNA聚合酶 催化PCR反应 一、限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子内部的特异DNA序列并在其内部或周围通过水解3′，5′-磷酸二酯键将DNA链打断的核酸内切酶。绝大多数的限制性核酸内切酶来源于细菌，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰体系（restriction modification systerm），主要用于限制外源DNA、保护自身DNA。
（一）命名原则及分类 限制酶的命名根据首次发现该酶类的细菌的属名与种名相结合的原则，通常用三个斜体字母的缩略语来表示。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；
第二、第三个字母取自该细菌的种名，用小写；
若细菌有株系，则用第四个字母代表株；
若同一菌株含有多种限制酶，则用罗马数字表示其发现和分离的先后顺序。
例如：
EcoR I ：E 代表Escherichia属 co代表coli种 R代表RY13株 I代表该菌株发现分离出的第一种酶 限制酶根据结构及作用方式不同可分为三类：I型、II型及III型，反应均需要Mg2+参与。I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别序列的任意处切割DNA链。因其不能产生特异性的限制片段和明确的凝胶电泳条带。III型限制性内切酶也是一类兼有限制一修饰两种功能的酶。它们在识别序列之外附近切开DNA链，并且要求DNA分子中存在两个反向的识别序列以完成切割，这类酶很少能产生完全切割的片段。由于I型和III型酶的特异性不强，因此，都不具备实用价值，基因工程不使用。
我们通常所说的限制酶是指II型限制性核酸内切酶，它能在其识别序列内部或附近特异地切开DNA链，其切割位点的序列可知、固定，其产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此，只有II型限制性核酸内切酶在基因工程中得到广泛应用，是最重要的工具酶。
（二）II型限制性核酸内切酶作用特点 1．识别序列的碱基个数 II型限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列为4bp、6bp、8bp。例如Not I的识别序列为GCGGCCGC；
EcoR I的识别序列为GAATTC。如果DNA中的碱基序列是随机排列的，则一个识别4bp的限制酶出现识别并切割的位点的频率，可能是每隔256bp(44bp）就会出现一次。依此类推，识别的6bp或8bp出现的间隔分别是46bp和48bp。对一段特定的DNA而言，限制酶识别的序列越短，切割位点数越多，切割后产生的片段也越小；
相反识别的序列越长，则切割位点数越少，切割后产生的片段越大。
2．识别的序列为回文结构 II型限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列具有回文结构(palindrome)，又称为二元旋转对称结构或反向重复序列，指在两条核苷酸链中，从5′→3′方向的核苷酸序列是一致的。如EcoR I的识别序列，在两条核苷酸链中，从5′→3′方向都是5＇-GAATTC-3＇。
3．切割产生粘性末端或平端 不同的限制酶切割双链DNA的方式也不尽相同。大多数酶交错切开DNA，产生带有5＇或3＇单链突出的末端，称为粘性末端(sticky end)。
如EcoRI切割DNA后产生5＇粘性末端：
→ 5＇-G↓AATTC-3＇ 3＇-CTTAA↑G-5＇ 5＇-G 3＇-CTTAA AATTC-3＇ G-5＇ + 也有部分限制性核酸内切酶切开DNA后，产生5＇或3＇端平齐的末端，称为平端(blund end)或钝端。如Sam I切割后产生平端：
→ 5＇-CCC↓GGG-3＇ 3＇-GGG↑CCC-5＇ 5＇-CCC 3＇-GGG GGG-3＇ CCC-5＇ + （三）异源同工酶和同尾酶 1．异源同工酶 有些限制酶虽来源不同，但能识别和切割同一序列，称为异源同工酶（isoschizomers）或同裂酶。如Bst I和BamH I能识别同一序列并在相同位点切割 (G↓GATCC)。产生相同的粘性末端。
2．同尾酶 有些限制酶虽识别序列不同，但切割DNA序列后产生相同的粘性末端，称为同尾酶（isoaudamers)，如BamH I(G↓GATCC)和Sau3AI(N↓GATCN）。产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end)。配伍末端相互可进行连接，但连接后的序列不能再被原先的酶识别切割。
（四）影响限制性核酸内切酶作用的因素 影响限制性内切酶作用的因素包括DNA的纯度及结构、DNA的甲基化程度、缓冲液、反应温度、作用时间等。酶单位数是以切割线性DNA为标准规定的，消化其他类型DNA时应根据DNA分子大小、形状等适当增加或减少所需的酶量。
1．DNA的纯度和结构 DNA样品中残留蛋白质、RNA和有机溶剂等杂质或高分子量DNA、超螺旋DNA均会降低内切酶的消化效率。
2．DNA甲基化 限制性核酸内切酶识别和切割的DNA序列甲基化后不能被识别切割，DNA序列中甲基化的程度及位置均会影响限制性核酸内切酶的作用。
3．反应缓冲液 限制性核酸内切酶反应缓冲液的主要成分包括Tri-HCl、氯化镁、氯化钠或氯化钾、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇、牛血清白蛋白及甘油等。不同的限制性内切酶对缓冲液盐浓度的要求各不相同。一般配制低盐（10mmol/L NaCl)、中盐（50mmol/L NaCl）和高盐（100mmol/L NaCl）3种缓冲液，用于满足不同酶的消化反应。当用两种酶消化DNA时，若各种酶所需盐浓度相同，则消化可同时进行；
若需要的盐浓度不相同，则必须先用低盐浓度的限制性内切酶消化后，再调整到高盐缓冲系统，加入高盐浓度的限制性内切酶，继续消化。由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过5％（V/V）会抑制内切酶的作用，因此在20μl反应体系中，甘油浓度应少于1μl。
4．反应温度及时间 不同限制性内切酶的最适温度不同，大多数酶的最适反应温度为37℃，个别例外，如Sma I为25℃，Bcl I为50℃。反应时间可根据酶和底物的量加以调整，时间太长可能使酶产生非特异性切割，太短则消化不完全。
5．限制性核酸内切酶纯度和用量 酶的纯度及酶的用量对酶切反应有一定的影响。
二、T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）是一单链多肽，分子量为68kD，可催化一个双链DNA的3＇羟基与另一双链DNA的5＇磷酸基团形成3＇，5＇-磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA片段连接起来。
三、DNA聚合酶I DNA聚合酶I（DNA polymerase I）是第一个从大肠杆菌中发现的DNA聚合酶，由单条多肽链构成，分子量为109kD。该酶具有三种酶活性：5＇→3＇DNA聚合酶活性、5＇→3＇核酸外切酶活性和3＇→5＇核酸外切酶活性。可用于DNA探针缺口平移标记、3＇粘性末端的标记等。
DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段又称klenow片段（klenow fragment），保留了5＇→3＇DNA聚合酶活性及3＇→5＇核酸外切酶活性。Klenow片段主要用于：① 补齐双链DNA的3＇末端；
② 补齐的同时可对3＇末端进行标记；
③ 合成cDNA的第二条链；
④ DNA序列测定。
四、反转录酶 反转录酶（reverse transcriptase）催化以RNA为模板合成cDNA的反应，合成方向为5＇→3＇。反转录酶缺乏3＇→5＇核酸外切酶活性，但具有RNaseH活性，可从5＇或3＇末端特异的降解RNA-DNA杂交分子的RNA链，是用于构建cDNA文库、反转录PCR等技术中的关键工具酶。
五、末端转移酶 末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT），又称末端脱氧核苷酰转移酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶无需引物即能催化dNTP按5＇→3＇方向逐个加在DNA分子的3＇羟基末端。该酶是一种非特异性酶，4种dNTP中任何一种均可作为其底物，主要用于DNA 3＇末端的标记或同聚尾加尾，制备便于重组连接的人工粘性末端；
或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行基因克隆。
六、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）可去除DNA或RNA链5＇末端的磷酸基团。在载体和目的DNA重组的过程中，用碱性磷酸酶水解载体5＇端磷酸基团，可防止其自身连接环化，提高重组效率。DNA和RNA片段进行5＇端标记前需用该酶处理。常用的碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIP）两种。CIP在1% SDS溶液中68℃加热15分钟可失活，因此较为常用。
七、其他工具酶 基因工程中还常会用到其他工具酶，例如TaqDNA聚合酶及其他耐高温DNA聚合酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、T4多聚核苷酸激酶等。
第二节 基因工程的载体 目的DNA片段不具备自主复制能力，即使导入宿主细胞，也不能随宿主细胞的增殖而复制和表达，从而达不到使外源DNA片段扩增的目的。因此，目的DNA必须借助载体DNA分子才能进入宿主细胞进行复制和表达。载体（vector）就是能携带外源目的DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子，大多数载体为环状双链DNA，少数为线性。目的DNA片段与载体在体外连接，构成重组分子，然后导入宿主细胞，使之进行扩增或表达。
载体按功能分为克隆载体（cloning vector）和表达载体（expressing vector），前者用于克隆和扩增外源DNA片段；
后者用于表达外源基因。有些载体兼备克隆和表达两种功能。
理想载体必须具备的条件：① 包含一个复制起始点，在宿主细胞内可独立自主进行复制；
② 易于从宿主细胞中分离提纯；
③ 具备一个或多个筛选标记，利于筛选克隆的重组子；
④ 包含多个限制酶的切点，即多克隆位点（multiplecloningsite，MCS)，便于目的基因的插入；
⑤ 具有较高的遗传稳定性。
以大肠杆菌为宿主细胞的载体主要有：质粒、λ噬菌体、粘粒和M13噬菌体。近年来发展了一系列新的载体系统，它们能在细菌中扩增，在真核细胞中表达。随着基因治疗研究的深入，构建了一系列病毒载体系统。
一、常用的克隆载体 （一）大肠杆菌克隆载体 以大肠杆菌为宿主细胞的载体主要有质粒、λ噬菌体和粘粒。
1．质粒 质粒（plasmid）是常用的克隆载体。是独立存在于细菌染色体之外，能自主复制的闭合环状双链DNA分子。天然质粒通常缺乏高质量的克隆载体所必须的元件，需通过人工构建才能应用于基因工程中。质粒一般具有以下特征：① 分子相对较小，大小从2～200kb不等，能在细菌内稳定存在；
② 具有松弛型复制子；
③ 具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，例如抗生素的抗性基因Ampr、Tetr等；
④ 具有多个限制性内切酶的切点，便于外源基因的插入；
⑤ 有较高的拷贝数。
(1) pBR322质粒 pBR322质粒是较早构建的一种质粒载体，分子相对较小，仅4363bp，具有氨苄青霉素抗性（Ampr）和四环素抗性（Tetr）两个基因，许多重要的单一限制酶位点密集于Ampr和Tetr区，便于外源DNA的插入和筛选，见图9-1。
图9-1 pBR322质粒物理图谱 （2）pUC系列质粒 pUC系列质粒是在pBR322质粒载体的基础上改造而成的，长度约为2.7kb，包含一个氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ基因）的α片段，lacZ基因的α片段编码β-半乳糖苷酶N端的氨基酸序列（146个氨基酸残基），Puc质粒结构见图9-2。
图9-2 Puc18质粒物理图谱 （3）穿梭质粒 穿梭质粒(shuttle plasmid)是人工构建的具有两种不同的复制起点和筛选标记、能在两种不同种属的受体细胞中存活和复制的质粒。克隆在此类载体上的外源基因可以不必更换载体直接从一种受体细胞转入另一种受体细胞中复制并遗传。例如大肠杆菌一酵母菌穿梭质粒（如YEp13)、大肠杆菌一枯草杆菌穿梭质粒（如pBE2）、大肠杆菌一动物细胞穿梭质粒（如pBPV-BV1）、大肠杆菌一植物细胞穿梭质粒（如Ti质粒）等。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草杆菌、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。因此大多数真核载体都构建成穿梭质粒。大肠杆菌一酵母菌穿梭质粒YEp13的结构中，包含pBR322的完整序列、2μm质粒的复制起点和酵母选择基因LEU2等。
质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段，主要用做亚克隆载体。一般说来，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
2．噬菌体载体 噬菌体（bacteriophage，phage）是一类感染细菌的病毒，常用作克隆载体的噬菌体主要有λ噬菌体和M13噬菌体两种。两者的基因结构与生物学性状各不同，用途也不同。
（1) λ噬菌体载体 野生型λ噬菌体DNA是一种双链线性DNA分子，全长48.5kb，两端各带有一条由12个碱基组成且互补的5＇单链粘性末端。λ噬菌体在大肠杆菌中繁殖所需的序列在左右两臂，中间大约40％的区域不是病毒生活所必需，可以除去。λ噬菌体感染大肠杆菌后，线性DNA分子即借助两端的粘性末端互补配对形成环状分子，连接区域称为cos位点(cohesive-endsite)，是噬菌体包装的必需序列。只有当含有外源DNA的重组λDNA大小是野生型λDNA长度的75％~105％时，才能在体外被包装成噬菌体颗粒，λ噬菌体载体的体外包装见图9-3。
图9-3 λ噬菌体载体的体外包装示意图 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出上百种克隆载体，可分为两类：① 插入型载体。插入型载体（insertionvectors）一般只有一个限制性酶切位点可供外源DNA插入，只容许小于10kb的DNA插入，通常用于构建cDNA文库或小片段DNA的克隆。如λgtl0和λgtl1是目前应用较广的插入型载体。能克隆7kb以下的外源DNA片段。λgtl0大小为43.3Kb，含有CI基因（λ阻遏蛋白基因），外源基因插入后CI基因失活，使大肠杆菌形成透明噬菌斑，而未重组的λgt10则不形成透明斑点；
λgt ll大小为43.7Kb，含有β-半乳糖苷酶基因的α片段（lacZ＇基因），外源基因插入后使其失活，在含X-gal的培养基上产生白色噬菌斑，而未重组的λgt11形成蓝色斑点，因此很容易区分重组子和非重组子。②置换型载体。置换型载体（replacement vector），有多个限制性酶切位点，经酶切后，两个位点之间的kDNA区段是入噬菌体的非必需区，可被外源DNA插入取代，可承受较大（9 Kb ~23Kb)的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆真核生物的染色体DNA，多用于真核生物基因组文库的构建。目前常用的有EMBL系列和Charon系列等。噬菌体置换型载体EMBL4结构见图9-4。
图9-4 EMBL4置换型载体 （2）M13噬菌体载体 载体M13噬菌体是一种丝状噬菌体，可感染含F因子的大肠肝菌，其基因组为单链闭环DNA分子，长度约为6.4kb。M13噬菌体感染大肠杆菌后，在细菌体内以单链DNA为正链复制出互补的负链DNA，形成双链环状DNA,称为复制型(RF)M13DNA。当感染细胞内累计有100个—200个RF DNA时，由于特殊蛋白质的参与，此时，DNA的合成几乎只产生子代正链DNA，并以出芽的形式释放出新的带有正链DNA的噬菌体颗粒。复制型M13DNA可以作为克隆载体。M13噬菌体的最大优点在于从细菌释放出的颗粒中所含的是单链DNA，只与被克隆的互补双链中的一条同源，因此可用该单链作模板进行DNA序列分析，或作为标记探针用于杂交分析，也可以作为体外诱变的模板。受Ml3噬菌体感染的细菌生长受到一定的抑制，在细菌培养基上会形成浑浊的噬菌斑。
野生型的M13DNA无常用的限制酶酶切位点，因此需要构建。在其DNA的IV基因和II基因之间，插入一段lacZ’基因，它包含lacZ调控序列及编码β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的DNA序列，在lacZ’基因中还插入了多克隆位点。Mp系列克隆载体是M13的衍生物，常见的有M13mp18和M13mp19等，二者的区别仅在于lacZ’基因内部多克隆位点的顺序恰好相反。含有lacZ’基因的载体在进行DNA重组后，可以利用是否产生蓝白色噬菌斑或菌落）进行筛选。
3．粘性质粒 粘性质粒(cosmid) 又称粘粒，是一种为克隆大片段DNA而设计构建的杂合载体。它由质粒DNA与λDNA的cos位点序列共同构建而成，具有质粒与入噬菌体DNA载体的双重性质，为环状双链DNA载体。
粘粒的特点表现在以下几个方面：① 含有质粒的复制起始点、限制酶切点及抗药性标记。当重组的粘粒在体外包装成病毒颗粒并感染大肠杆菌后，可按质粒复制的方式进行扩增；
② 含有λ噬菌体DNA的粘性末端（cos位点序列），可克隆较长的外源DNA(长达40Kb～50kb)，可在体外包装成噬菌体颗粒；
③ 本身分子较小，只有几kb，因此没有插入外源DNA的非重组粘粒不能在体外包装，利于筛选。
（二）酵母克隆载体 酵母载体大多数是由细菌质粒DNA与酵母DNA构造成的穿梭质粒。目前常用的酵母克隆载体有酵母整合质粒、酵母复制质粒、酵母附加质粒及酵母人工染色体等。
1．酵母整合质粒 酵母整合质粒（yeast integrative plasmid，YIp）是在大肠杆菌质粒pBR322的基础上插入了一个酵母标记基因（如URA3、LEU2等），不含酵母的复制起点。YIp不能像质粒一样复制扩增，一般只以单个拷贝形式存在于细胞中，能产生稳定的重组子，但转化率极低。
2．酵母复制质粒 酵母复制质粒（yeast replicating plasmid，YRp）由一段包括复制起始位点（ARS）及多个酵母基因（如TRP等）在内的酵母染色体DNA和pBR322组成，可以进行复制独立。YRp转化率极高，在细胞中有很高的拷贝数，但其重组子非常不稳定，由于分配不均匀，母细胞中聚集的大量重组分子，在子代中可能造成拷贝数减少或丢失。
3．酵母附加质粒 酵母附加质粒（yeast episomal plasmid，YEP）是含有2μm质粒的载体。YEP可含完整的2μm质粒，也可只含2μm质粒的复制起点和标记基因，其转化频率、在细胞中的拷贝数及稳定性与YRp相似。
4．酵母人工染色体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）是利用酵母染色体DNA与细菌质粒pBR322改造而成的DNA分子，具备着丝粒（centromere，CEN）、两个端粒（telomere，TEL)、自主复制序列（ARS）、选择标记（如TRP1和URA3）、大肠杆菌复制起点、Ampr 基因及限制酶酶切位点等序列。YAC装载容量大，可插入0.5Mb～2Mb的外源DNA片段，用于大片段DNA的克隆，可代替λ噬菌体载体和粘粒载体来构建文库，人类基因组计划即采用该载体来构建物理图谱。
pYAC3是在pBR322基础上插入酵母基因构建而成，长11.4kb。插入的酵母基因包含URA3、TRP1和SUP4标记基因以及一个复制起点。克隆时，外源DNA插入SUP4基因使其失活，重组YAC导入trpl-ura3双营养缺陷的受体酵母菌，在缺乏色氨酸和尿嘧啶的培养基上长出白色克隆，非重组子则长出红色克隆，很容易判断载体中是否插入了外源基因。
（三）病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞 近年来，在人类遗传病和恶性肿瘤的基因治疗研究中，常常采用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体，将外源基因导入受体细胞，以达到纠正遗传缺陷或杀死肿瘤细胞的目的。多数病毒载体均己质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记、以及pBR322的复制起始点组成。
二、常用的表达载体 表达载体是用来在宿主细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体DNA。该类载体不仅具有复制起点、选择标记及多克隆位点等一些克隆载体所具备的性质，还包含转录和翻译所必需的DNA序列，如启动子、转录终止序列和核糖体结合位点等。根据受体细胞不同，表达载体分为原核表达载体和真核表达载体两类。
（一）原核表达载体 1．原核表达载体结构 以典型的大肠杆菌表达载体为例，原核表达载体具有以下结构特点：含有一个复制起点、克隆位点和筛选标记基因；
具有核糖体结合位点；
具有强启动子和强终止子。大肠杆菌表达载体常用的启动子有tac启动子、lacUV5启动子、λ噬菌体PL启动子和T7噬菌体启动子等。大肠杆菌表达载体的结构模式见图9-5。
图9-5大肠杆菌表达载体的结构模式图 2．原核表达载体分类 原核表达载体按功能分为三类：① 融合蛋白表达载体：目的基因连接于载体启动子后原核结构基因的下游，与载体的结构基因共用同一启动子，使目的基因与载体结构基因以融合的形式表达。通常构建于质粒载体上的原核蛋白包括谷胱甘肽巯基转移酶（GST）和分泌蛋白A等。pGEX-4T-1是一种常见的融合表达质粒载体，含有lacI、Ampr和来自pBR322的复制起点ori，在tac启动子后有一段融合蛋白GST基因序列，紧接其后的是多克隆位点，便于外源目的基因插入。② 非融合型表达载体：该载体表达出的外源蛋白N端不含任何原核生物肽段，即将外源基因插入载体的原核启动子和核糖体结合位点下游，使翻译起始位点ATG位于外源基因片段的5＇端，这样就可以在原核宿主中表达出非融合蛋白。如pKK223-3载体就是一种非融合型表达载体。③ 分泌型表达载体：该载体表达出的外源蛋白N端与原核的信号肽连接在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质或培养基中。
（二）真核表达载体 真核表达载体通常含有选择标记、复制起始位点、启动子、转录终止序列、poly（A）加尾信号及克隆位点。真核表达载体大多数为穿梭载体，有两套复制起点和选择标记，分别在原核和真核细胞中起作用。常见的真核表达载体有酵母表达载体和哺乳动物细胞表达载体。
1．酵母表达载体 酵母表达载体多数为穿梭质粒，在酵母和大肠杆菌中均能进行复制、扩增。通常含有复制起始序列、启动子、筛选标记、分泌信号、终止子、有丝分裂稳定区及外源基因克隆位点。
酵母作为酵母表达载体的宿主有许多优越性：① 作为单细胞生物，其操作和生产相对简单，成本低廉。② 具有蛋白质翻译后加工和修饰系统可将表达的外源蛋白分泌到培养基中，便于纯化。③ 具有MOX（Methanol Oxidase)、AOX（Alcohol Oxidase)及lac4等强启动子。
2．哺乳动物细胞表达载体 原核启动子在哺乳动物细胞中不能发挥作用，但有些动物病毒载体的启动子，如人类巨细胞病毒（CMV）启动子、Rouse肉瘤病毒基因组长末端重复序列（RSV）中的启动子等宿主范围较广，在多种受体细胞中可能有一定的活性。因此，目前构建的许多哺乳动物细胞基因表达载体主要来源于动物病毒的基因，如腺病毒载体、反转录病毒载体、空泡病毒载体（SV40）、牛乳头瘤病毒载体等。病毒载体能相对高效、安全、稳定地将外源基因携带进入宿主细胞并实现表达。
人工构建哺乳动物细胞载体应具备以下条件：① 含有原核复制起始位点及抗生素抗性基因。利于外源基因片段的克隆与筛选。② 具备真核细胞筛选标记基因。常用的标记基因有：胸苷激酶基因（thymidinekinase，TK）、二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase，DHFR)、氯霉素乙酰转移酶基因（chloramphemcolacetyltransferase，CAT)、新霉素抗性基因（neomycinresistance，NEO）等。③ 含有转录终止信号和polyA加尾信号。④ 具有哺乳动物细胞启动子和增强子。
⑤ 含有可选择的剪切信号。⑥ 含有一个以上的限制酶的单一酶切位点。便于真核基因的插入。
第三节 基因工程的基本原理和步骤 基因工程的基本步骤主要包括：① 目的基因的获取。② 载体的选择与构建。③目的基因与载体连接形成DNA重组体。④ DNA重组体导入宿主细胞。⑤ DNA重组体的筛选与鉴定。⑥ DNA重组体的扩增及表达。基因工程的基本步骤见图9-6。
图9-6基因工程的基本步骤 一、目的基因的获取 1．从基因组DNA文库获取 基因组文库(genomic library）是指含有一个机体细胞基因组DNA的全套重组DNA分子的集合。从基因组文库中筛选目的基因可以通过核酸分子杂交的方法进行，即用放射性核素标记已知序列的DNA片段，后者与基因组文库中的所有克隆进行杂交，经放射自显影筛选出阳性克隆，获得目的基因。
2．从cDNA文库获取 cDNA文库（cDNAlibrary）是以提取的组织细胞总mRNA，经反转录酶催化合成的双链cDNA（complementaryDNA，cDNA）与适当载体连接后转入受体细胞构建而成的。从cDNA文库中获取目的基因的方法与从DNA文库中获取的方法相同。此外，从 cDNA文库中获取还可以利用特异性抗体或特异性结合蛋白筛选目的基因。
3．PCR法获取 利用PCR可直接以基因组DNA或cDNA为模板高效快速地扩增出目的基因，但前提是必须知道目的基因5＇、3＇端的各一段核苷酸序列，以设计合成适当的引物，从而可以获得特定的目的基因。
4．化学人工合成法获取 如果目的基因的序列已知，或能根据其蛋白质产物的氨基酸序列推导出此基因的核苷酸序列，则可以利用DNA合成仪通过化学方法合成目的DNA。此法适用于合成较小的DNA片段（100bp左右），较长的链可分段合成，然后用连接酶按一定顺序加以连接。
二、载体的选择与构建 目的基因必须由合适的载体携带才能进入宿主细胞进行复制和表达。选择合适的载体主要依据基因工程的目的、操作基因的性质和大小，同时还要考虑载体中是否有合适的限制性酶切位点。几种常用克隆载体的性质和用途见表9-2。
表9-2 常用克隆载体的性质和用途 载体 插入目的DNA大小 受体细胞 质粒 <10kb 细菌、酵母 λ噬菌体 <20kb 细菌 粘粒 <50kb 细菌 BAC <400kb 细菌 YAC <3Mb 酵母 无论选用何种载体，首先都要获得载体分子，即分离纯化入噬菌体DNA或制备粘性质粒和其他有关质粒DNA。获得载体DNA后，采用适当的限制性核酸内切酶将载体DNA进行切割。质粒、粘性质粒、M13噬菌体复制型DNA分子经酶切后得到单一的线性分子；
λ噬菌体DNA则是获得左臂和右臂两个线性分子。获得线性DNA分子后，用碱性磷酸酶处理，去掉5＇端磷酸，以便于与目的基因片段进行连接。
三、目的基因与载体连接 经过不同途径获得的目的基因与构建好的载体分别经限制性核酸内切酶消化后，由DNA连接酶催化两个DNA片段在体外连接形成重组DNA分子。体外连接的方式主要有以下四种：
（一）粘性末端连接 目的DNA和载体DNA由同一种限制酶切割后产生相同的粘性末端，或由不同的限制酶切割形成的互补黏性末端（即配伍末端），当两者一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后由DNA连接酶连接末端的缺口，成为环状重组DNA分子，此种方法最适合DNA片段连接。由一种限制酶处理过的载体因两端的碱基序列互补，可发生自身环化，形成空白载体，从而降低重组效率，为目的基因的筛选带来困难。避免的方法之一是用碱性磷酸酶处理酶切后的载体，可防止其环化。
（二）人工接头连接 人工接头（linker）是指人工设计合成的含有一个或多个限制酶识别位点的一段双链脱氧核苷酸片段。对于平末端的DNA可先与人工接头连接，产生新的限制性酶切位点，经切割后，可按粘性末端连接方式进行连接。
（三）平末端连接 DNA经限制酶切割后产生平末端，或是粘性末端经特殊酶处理，将突出的末端削平或补齐，变为平端，均可在T4 DNA连接酶催化下连接。平端连接效率远低于粘性末端连接，且不能避免载体DNA的自身环化，目的基因的插入载体还会出现正反两种方向的可能性，但是，这种连接方法适合于任何DNA片段的连接。为提高连接效率，在连接这样的DNA片段时，可适当提高连接反应中ATP及T4 DNA连接酶的浓度。
（四）同聚物加尾连接 加入同聚物（homopolymer)尾是处理不易连接的DNA片段的另一种有效方法，在基因克隆中应用十分广泛。目的DNA经核酸外切酶消化，或用能产生3＇粘性末端的限制酶（如Pst I）消化，产生具有3＇羟基的单链末端，暴露出的3＇羟基末端在末端转移酶的催化下，将某种单一脱氧核苷酸底物逐一加到3＇羟基末端，形成相应的脱氧核苷酸同聚物尾（如多聚G)。载体DNA则可加上与目的DNA同聚物尾互补的脱氧核苷酸同聚物尾（如多聚C）。将两者混合后，两种DNA分子通过互补的同聚物尾互补配对形成氢键，末端间的空隙在导入宿主菌后可由DNA聚合酶I自行修复连接。
四、重组DNA导入受体细胞 重组DNA分子必须导入宿主细胞，才能进行复制、表达、扩增。宿主细胞又称受体细胞，分为原核细胞和真核细胞两类。原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等，其中以大肠杆菌最为常用。真核细胞包括酵母、植物细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
将重组DNA导入宿主细胞的方式有转化、感染和转染。转化(transformation)是将质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入受体细胞，使其获得新的表型的过程，常用宿主菌是大肠杆菌。转染(transfection)指将表达载体导入真核细胞的过程。感染是以噬菌体或病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的噬菌体或病毒颗粒，然后感染适当的宿主细胞，并将重组DNA导入宿主细胞。
作为基因工程的宿主细胞应具备以下特征：① 安全性高，有感染寄生缺陷。如原核细胞常用从大肠杆菌K12改造的安全宿主菌，在肠道内无存活率或存活率极低。② 易于转化。③ 为限制—修饰系统缺陷型。重组DNA导入宿主细胞（大肠杆菌）后可能因宿主限制酶的消化而遭破坏，因此须选用R-(restriction negative)菌株。④ 重组缺陷型。为了避免重组DNA自发地与宿主染色体DNA发生重组，应选择Rec-（recombination negative)菌株。⑤ 遗传表型具有互补功能。为便于转化细胞的筛选，尽量选择目的基因功能缺陷的宿主细胞。
（一） 转化法 氯化钙转化法将处于对数生长期的大肠杆菌悬浮于冰冷的氯化钙低渗溶液中，细胞发生膨胀，细胞膜磷脂层形成液晶结构，并解离细胞外膜与内膜之间的部分核酸酶，促使细胞成为具有摄取外源DNA能力的细胞，即感受态细胞(competent cell)。Ca2+能与DNA分子结合成抗DNA酶的羟基—磷酸钙复合物，并粘附于细胞膜表面。经42℃热休克处理1分钟，细胞膜液晶结构发生改变，通透性增加，形成间隙，外源DNA随即进入细胞内。
（二）转染法 转染是由转化和感染两个单词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被导入外源DNA片段而获得新的遗传表型的过程。常用的方法有电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法等。进入宿主细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在宿主细胞染色体外存在和表达。
1．脂质体转染法 阳离子脂质体(cationicliposome)是由中性磷脂和阳离子脂质组成的一种磷脂双分子层膜性结构。利用脂质体将外源基因导入到真核细胞是一种常用的简单而快速的基因导入方法。其原理是阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，DNA被包裹在脂质体中间。这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞质中。进入细胞的基因可在细胞中酶的作用下进行表达，但不能整合。脂质体转染法对宿主细胞无损伤，且转移效率高。这种温和的基因转移方法适用于将各种类型核酸分子导入培养的细胞内。
一种新型脂质体Lipofection即是由阳离子脂质（DOTMA）和中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）合成的。其作用机制与传统脂质体不同，并非将核酸包入脂质体囊内，而是阳离子脂质体通过静电引力作用与带负电荷的DNA自发形成DNA一脂质体复合物，净电荷为正的复合物又很容易吸附到带负电荷的细胞膜表面，与细胞融合，通过细胞内吞作用进入胞内。此法适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞，且转染时不需加入血清和抗生素。可用于瞬时转染和稳定转染，转染效率高、稳定性好，近几年被广泛用于将DNA、RNA和蛋白质导入活细胞。
2．DNA-磷酸钙转染法 将待转化的DNA与氯化钙、磷酸缓冲液混合，形成包含DNA的微小磷酸钙颗粒，这些磷酸钙一DNA复合物粘附到细胞膜表面，细胞通过胞饮作用摄入外源DNA。此法能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究，但转化效率较低。
3．电穿孔法 电穿孔法（electroporation）是通过短暂的高压脉冲电场使细胞膜产生瞬时的可逆性微孔通道，从而将重组DNA分子导入细胞内的方法。此法的转化效率受细胞状态、电压（0.2-2kV)、电容（25-1000μF）、DNA浓度及脉冲时间（0.5-5毫秒）等因素影响。多适用于悬浮培养细胞，也可用于大肠杆菌的转化。由于操作的稳定性较好，在基因工程中应用很普遍。
4．显微注射法 在制备转基因动物时，可将外源基因通过毛细玻璃管在显微镜下直接注射到受精卵的细胞核内，这种基因转染方法称为显微注射法（microinjection)。
除此之外，还有DEAE-葡聚糖转染法等多种转染方法。
（三）感染法 此法模拟了病毒感染细胞的生物过程，以病毒DNA为载体，将外源基因直接转染特定的受体细胞。该方法具有定向性好、导入效率高等优点。例如，将重组λ噬菌体DNA在体外包装成完整的噬菌体，然后感染大肠杆菌，即可将重组DNA导入细胞。具有感染能力的噬菌体颗粒包装方法。是将重组λDNA与含有大量噬菌体尾部蛋白的λ噬菌体突变株的宿主溶菌物，和含有大量噬菌体头部蛋白的另一突变株Dam的宿主溶菌物混合，即可包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。
重组反转录病毒载体的体外包装需要辅助细胞（如ϕ-2细胞）的参与。ϕ-2细胞能表达反转录病毒的全部基因产物，但由于缺乏包装位点（ϕ位点），不能包装其病毒RNA产生新的辅助病毒颗粒。如果用重组反转录病毒载体感染ϕ-2细胞，由于其RNA中含有位点，可被ϕ-2细胞提供的蛋白质包装成新的反转录病毒，感染宿主细胞后，经过反转录得到双链DNA，整合入宿主的基因组中。
这种感染方法目前比较常用，可经过包装的逆转录病毒能直接感染宿主细胞，进行逆转录，整合入宿主细胞基因组，并表达外源基因。
利用上述种种方法能将外源基因导入真核宿主细胞，但是只有极少数细胞能将外源基因整合到其基因组内，并且稳定地表达。为了便于鉴定这些稳定转染的细胞株，常将一些选择标记基因与目的基因连接在同一重组载体上，进行转染，由于表达特定的选择标记基因，使重组体能够被筛选与鉴定出来。
五、重组体的筛选与鉴定 筛选（screening）就是从被转化的细胞群中鉴别出真正含有目的基因的转化子。将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的筛选方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。
（一）抗生素抗性筛选 利用克隆载体携带的某种抗生素抗性基因，这种抗生素抗性基因应是受体菌或细胞的缺陷性基因。有含这种完整抗性基因的转化菌能在含该抗生素的培养基上生存并形成菌落，非转化菌则被杀死。这种遗传学选择方法，是从一个数目庞大的细胞群体中筛选特定细胞的最为有效的方法。
有的质粒带有两种抗生素抗性基因，当外源DNA插入到其中一个抗性基因中时，该基因就会失活，重组质粒转化的细菌就不能在含有该抗生素的培养基上生长，而能在含有另外一种抗生素的培养基中生长。由于非重组质粒在含两种抗生素的培养基上均能生长，所以此法常用于区分质粒的重组体和非重组体。
（二）蓝白筛选 蓝白筛选又称为α-互补筛选。此筛选法为功能互补筛选，是带有β-半乳糖苷酶N端长146个氨基酸的α片段的载体，与带有β-半乳糖苷酶C端序列（ω片段）的受体细胞互补。单独存在的β-半乳糖苷酶α片段和ω片段均无β-半乳糖苷酶活性。但二者共存时可产生β-半乳糖苷酶酶活性，在IPTG的诱导下，能将无色的人工底物X-gal水解生成蓝色产物，从而形成蓝色菌落（或噬菌斑），而无β-半乳糖苷酶活性菌落（或噬菌斑）呈现白色。故这种筛选方法也称为“蓝-白筛选。
如含LacZ’基因（α片段）载体（如PUC系列质粒、λgt11等）的筛选鉴定。载体中的LacZ’基因的编码产物为β-半乳糖苷酶α片段；
转化表达β-半乳糖苷酶ω片段的宿主菌（突变型lac-E.coli）。如果外源基因插入LacZ’基因的多克隆位点上，则LacZ’基因失活，不能产生α片段，丧失了α-互补能力，从而使菌落（或噬菌斑）呈现白色。而在多克隆位点上没有成功插入目的基因的载体，转化了表达β-半乳糖苷酶ω片段的宿主菌生长的菌落（或噬菌斑）成蓝色。由于载体同时具有抗生素抗性基因，所以没有成功转化载体的受体菌，则不你生长。这种颜色标志，使重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。
（三）核酸杂交筛选 核酸杂交筛选是直接针对克隆的目的基因的筛选。常用的杂交方法有菌落的原位杂交和Southern杂交。菌落的原位杂交是先将硝酸纤维膜或尼龙膜覆盖在生长的琼脂平板上的菌落或噬菌斑上，定位好，轻轻揭起膜，这样将有部分细菌或噬菌体吸附于膜上，再处理膜上的DNA，使之变性、烘干固定，然后用DNA或RNA探针杂交，用X光片曝光，筛选找到阳性菌落，进行克隆或表达培养。Southern杂交的筛选过程是从培养的不同菌落或噬菌斑中提取重组DNA，琼脂糖凝胶电泳分离后进行变性，转膜，然后与探针进行杂交，筛选出阳性克隆，并进一步进行培养扩增。
（四）限制酶酶切图谱筛选 使用常规方法提取重组DNA后，可直接进行琼脂糖凝胶电泳，如果插入载体的目的基因片段较大，则重组体迁移率明显小于载体，可直接筛选阳性克隆。如不能明确区分迁移率的重组体，可选择适当的限制性酶进行酶切，如能切出目的基因片段的克隆，在琼脂糖凝胶电泳图谱中即可观察到目的基因条带，即为阳性克隆。
（五）PCR筛选 根据目的基因两端序列设计引物，以克隆的DNA为模板进行PCR扩增，能扩增出大量目的基因的克隆，即为阳性克隆。PCR对阳性克隆的筛选十分有效，且无需提取DNA分子即可进行筛选。
（六）DNA序列分析筛选 直接对培养的克隆DNA进行序列分析，含有目的基因序列的克隆即为阳性克隆。同时，经其他筛选方法鉴定出的阳性克隆，也要最终对插入的目的基因进行序列分析，以进一步验证其准确性。
（七）免疫学方法筛选 免疫学方法是应用特异性抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，属间接选择法。如果克隆基因的表达产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，则免疫法特异性强、灵敏度高，可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选，适用于筛选不为宿主菌提供任何标志的基因。
六、重组体的表达 基因工程的主要目的之一是获得大量目的基因的表达产物—蛋白质。将目的基因按照正确的位置和方向与表达载体连接，然后导入相应的宿主细胞，培养含有重组体的宿主细胞即可得到目的基因的表达蛋白。主要的表达体系有原核表达体系和真核表达体系。
（一）原核表达体系 大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，将外源基因插入到原核启动子下游，由大肠杆菌RNA聚合酶识别该启动子，使外源基因转录出mRNA，进而翻译成蛋白质。
在原核表达体系中表达的目的基因需具备以下特点：① 无内含子。大肠杆菌缺乏真核转录后加工系统，不能剪切内含子，因此只能表达真核cDNA，不能表达基因组DNA。② 有强启动子及翻译调控序列。表达载体具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子（如tac、PL、T7等）及翻译调控序列（如翻译起始位点、SD序列等）。③ 有正确的阅读框架。外源基因插入表达载体后，必须形成正确的阅读框架，以得到正确编码的蛋白质。④ 不能含有信号肽等相应的DNA序列。因为大肠杆菌缺乏真核细胞特有的蛋白质翻译后加工修饰体系，如糖基化、磷酸化和信号肽的剪切等，所以，编码分泌性蛋白的真核基因必须删除信号肽的编码序列。
另外，目的基因插入载体DNA的位置和宿主的选择对表达蛋白的稳定性具有重要作用。表达的外源蛋白往往不够稳定，易被细菌的蛋白酶降解，可以通过表达融合蛋白的方式或选用缺乏相应蛋白酶的宿主菌来提高其稳定性。
融合蛋白是指表达的蛋白质或多肽链N端是由原核基因或其他特殊DNA序列编码的肽段（即融合标签），C端则由真核外源DNA编码。常用的融合标签包括、GST、6-His标签和GFP等。融合蛋白大大方便了表达产物的分离纯化，一般常常利用生物分子特异性相互作用来选择合适的亲和层析分离融合蛋白，这些特异性相互作用常见的有酶与底物的诱导契合、受体与配体之间的相互作用、抗原与抗体之间的特异性结合及其他作用方式（如Ni2+与6-His标签的结合）等。如果设计融合基因时，在目的基因与融合标签序列之间加入适当的裂解位点，则融合蛋白经化学处理（CNBr)或特异蛋白酶（如凝血因子X、胶原酶、肠激酶等）水解，很容易将目的蛋白从融合蛋白中释放出来。
原核表达体系融合蛋白的表达有几个优点：① 融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。② 如果载体携带的大肠杆菌结构基因片段编码一段信号肽，可产生分泌型产物。③ 可利用针对融合蛋白中原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。④ 原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。
选择适当的受体菌株和诱导条件的选择对提高原核表达体系的表达效率非常重要。对于一个特定的蛋白质来说，并不是在所有的菌株中都能获得相同的表达效率，有时需要试几种菌株，以选择最好的一种菌株。
表达产物的检测与鉴定方法主要有：① SDS-PAGE电泳鉴定。转化菌经过诱导表达，提取菌体蛋白，经SDS-PAGE电泳后，染色并脱色，观察是否出现与目的蛋白相应大小的蛋白条带。② Western杂交鉴定。如果SDS-PAGE初步证实存在目的蛋白条带，为进一步鉴定其特异性，常常利用能与之特异结合的抗体进行蛋白质杂交。③ 蛋白质生物活性测定。
蛋白质生物活性测定是判断外源基因是否表达的最有力证据之一。④ 蛋白质序列分析。
对目的蛋白进行氨基酸序列分析，以获得准确的最终结果。
（二）真核表达体系 结构复杂的蛋白质在原核细胞中不能被正确折叠或修饰，因而不具有生物学活性；
或目的基因为真核基因组DNA时，必须采用真核表达体系。克隆的基因要在哺乳动物细胞中进行表达，必须先将基因插入到适当的真核表达载体中。首先，重组的表达载体在大肠杆菌中进行扩增，并从大肠杆菌中提取和纯化重组表达载体，然后，将其导入真核表达体系进行表达。
在哺乳动物细胞中表达的基因，可以是基因组DNA，也可以是cDNA。质粒载体DNA可以用脂质体介导、电穿孔技术、DEAE葡聚糖或磷酸钙共沉淀等方法直接导入宿主细胞。病毒载体DNA则须先进行病毒颗粒包装，获得假病毒颗粒后再用于感染受体细胞。最终筛选出转染细胞后，持续培养，便可在上清中得到表达产物。转染细胞培养中，可持续添加抗生素，并逐渐加大药物浓度，增加选择压力，这样可提高阳性克隆的拷贝数，提高表达效率。
与其他表达系统相比，哺乳动物表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂、准确的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达的产物在分子结构、理化性质和生物学活性方面最接近于天然的高等生物蛋白质。目前，采用最多的受体细胞为COS细胞（猿猴肾细胞）和CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）。COS细胞来源于经SV40病毒转化的非洲绿猴肾细胞，其中COS-7是最常用的细胞系，能组成性地表达SV40大T抗原，使任何带有SV40复制起始位点的转染质粒能够以很高的拷贝数进行复制，是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主。COS-7一般用于病毒和转染研究以及对细胞基因转录的研究。CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生长，是用于真核生物基因表达较为成功的宿主细胞。
酵母是最简单的真核生物，具有遗传背景清楚、操作简单、易于发酵、成本低廉等特点，能像哺乳动物细胞那样对表达的蛋白进行折叠和翻译后修饰。各种不同酵母菌株对表达和分析真核蛋白是非常有用的。与哺乳动物细胞相比，酵母表达系统易于操作、价格便宜。因此，酵母表达系统也是适用于大规模表达重组真核蛋白的理想工具。
昆虫表达系统也是一个理想的重组真核蛋白表达系统。由于昆虫是高等真核生物，与哺乳动物类似，能进行翻译后加工和修饰。昆虫细胞生长速度快，培养条件简单，易于悬浮培养，因此在基因工程中可用于大规模表达蛋白质。主要有两类：果蝇表达系统和杆状病毒表达系统。
知识拓展 电子克隆体系 电子克隆（insilicocloning)是基因克隆的有效辅助手段。随着人类基因组计划和多种模式生物全基因组测序的完成、基因数据库的不断完善，以及各种计算机分析软件的开发与互联网的广泛应用，生物信息学已成为非常重要的一种研究方法，使人们有可能通过基因数据库进行序列搜索、对比分析、拼接整合，预测新的、假定的全长基因，然后通过分子生物学实验方法，加以证实，并从相应的组织、细胞中获得这种基因，这就是电子克隆。
在进行基因克隆时，与传统的基因克隆方法相比，电子克隆大大加快了新基因的发现速度，提高了工作效率。提供了一种基因存在可能性。各种基因数据库目前日趋十分完善，囊括有大量基因及其信息的数据库，以及各种分析和预测的软件都将辅助人们成为新型的技术方法之一。
第四节 基因工程的应用 随着基因工程的诞生和技术的发展，目前，基因工程已成为生物科学的核心技术，已经广泛应用于医药卫生和农牧业等众多领域，并取得了巨大成就。
一、基因的定点诱变 在工业生产上，常常希望所用的酶具有更长的半衰期、更高的稳定性，能够适应更广的酸碱度范围。在临床医学方面，希望所用的蛋白质或多肽药物的疗效更高、副作用更小、代谢半衰期更长。显然，天然蛋白质还不能完全满足上述各种需要。因此，需要对自然界存在的蛋白质进行改造，以进一步分析其功能，或者通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的相互作用，基因工程是其重要手段之一。例如，现已发展起来的各种体内或体外基因诱变方法，其中具有重要意义的是由Michael smith于1982年发明的寡核苷酸介导的定点诱变技术，简称定点诱变技术site directed mutagenesis)，是利用分子生物学技术，在体外通过核苷酸取代、插入或删除，从而使基因DNA序列中任何一个（多个）特定的核苷酸发生改变的技术。
基因工程定点诱变的基本原理如下：① 首先制备单链模板，即利用体外DNA重组技术，将待诱变的目的基因插入到复制型双链M13噬菌体载体上，转化细菌后，制备含有目的基因的M13单链DNA作为诱变的模板。② 根据需要设计并合成带有诱变核苷酸序列的寡核苷酸引物，并与带有目的DNA的单链M13模板进行杂交。③ 加入DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸，使杂交的寡核苷酸引物延伸。④ 用DNA连接酶将新合成的异源双链DNA连接成闭合环状分子。⑤ 转化宿主细菌，经过不断复制，即可获得诱变的DNA分子。⑥ 筛选带有诱变DNA的重组噬菌体，并提取单链DNA进行序列分析。⑦ 从重组噬菌体中提取含有诱变DNA的复制型DNA，以进一步对诱变DNA进行研究并扩增。
二、基因诊断与基因治疗 基因诊断是从基因水平上检验基因的存在状态与缺陷，从而对疾病作出诊断的方法。使用一个特定的DNA片段制成探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。目前人们已经利用基因工程技术发现了多种人类疾病（包括遗传病、恶性肿瘤、感染性疾病等）的致病基因，为疾病的诊断和治疗提供了坚实的理论基础。
基因治疗是从20世纪80年代发展起来用于预防和治疗疾病的最具革命性的生物医学医疗技术，其原理是将人或动物的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。
三、遗传病的预防 疾病基因的克隆不仅为遗传病的诊断、治疗提供了有力手段，更重要的是，将这一手段应用到产前诊断、症状前诊断，同时结合早期预防、积极治疗等措施，可有效预防遗传病患儿的出生及遗传疾病的发生。一般的表型诊断方法不可能在胎儿出生前和疾病发生前对遗传病进行诊断， 只有基因分析技术才能检测到胎儿的异常基因，是遗传病预防的最有效手段。
知识拓展 血红蛋白病的诊断 在基因诊断发展过程中，最早采用基因诊断的疾病就是遗传病。发展到现在，不仅是发病机制清楚、已找到致病基因的疾病可以进行基因诊断，一些发生分子机制不明的遗传性疾病也可以通过连锁分析进行基因诊断。
比如血红蛋白病、苯丙酮尿症、杜氏肌营养不良症等的基因诊断就是典型的例子。
血红蛋白病是由于血红蛋白结构或合成异常所致的遗传性血液病，习惯上分为异常血红蛋白和地中海贫血两大类。前者由珠蛋白基因突变引起的珠蛋白肽链结构改变所致，而后者由珠蛋白肽合成速率降低、α链和β链合成不平衡引起，也称为地中海贫血。
目前较普遍采用的是PCR扩增法，检测这两个基因的缺失情况，并在基因水平上对地中海贫血患者进行基因型分型。应用定量RT-PCR技术可测定β珠蛋白mRNA含量，并根据其改变作出诊断。该方法不仅可诊断地中海贫血，还能准确诊断β地中海贫血的杂合子。
四、基因工程制药 许多药物的生产是从生物组织中提取获得的，受材料来源限制，其产量有限，价格昂贵。利用基因工程技术生产有应用价值的药物不仅能解决产量问题，还能大大降低生产成本。世界上第一种基因工程药物是由美国Lllly公司于1982年率先利用基因工程技术生产上市的重组人胰岛素，它的诞生标志着基因工程药物时代的来临。用基因工程生产药物的效率高、成本低、品质好。迄今为止，已开发出数百种基因工程药物，包括胰岛素、干扰素、凝血因子、促红细胞生成素、人生长激素、各种单抗，以及预防乙型肝炎、伤寒、霍乱、疟疾的疫苗等。其中一部分已投入市场，另有一部分还处于临床试验的不同阶段。
临床应用 基因工程重组人胰岛素 基因定点诱变技术的应用，最经典的是以胰岛素的蛋白质工程为例，基因工程重组人胰岛素作为首个基因工程产品已于1982年投放市场。
胰岛素是治疗糖尿病的特效药物。胰岛素分子由A、B两条肽链组成，共含有51个氨基酸残基。它是第一个被测序的蛋白质，也是第一个被人工合成的蛋白质。临床上已有多种利用蛋白质工程制造的性能优良的胰岛素突变体。
例如一种定点诱变制备长效胰岛素，是将将人胰岛素B链27位的Thr改为Arg，将B链羧端氨基化和将A链21位Asn改为的Gly，它在血浆中的半衰期可延长至35小时。这主要是因为对胰岛素作了定点诱变之后，其等电点改变，延迟了吸收，从而实际上延长了吸收的半衰期。这种胰岛素类似物已具有较好的临床效果。每天注射一次这种长效胰岛素，可与天然胰岛素分泌水平相近。
还有一种定点诱变制备的胰岛素可被快速吸收。在正常生理情况下，胰岛素在体内是不断地分泌的。当人们进餐后，立即引起体内胰岛素水平升高，一个小时之内即可达到高峰，胰岛素可以下调血液中血糖水平，使之大约在3小时之内又恢复到基础水平。这样维持血液中血糖始终处于正常水平。但是，在用胰岛素治疗糖尿病时，不可能连续不断地进行注射，同时在皮下注射胰岛素时，吸收非常慢，还会导致高血糖。3至5小时之后胰岛素水平仍在继续上升，又将会导致低血糖状态。人们为了克服此缺点，利用蛋白质工程的方法制备单体胰岛素。注射单体胰岛素后，它能被快速吸收。
实际血液中循环的胰岛素其活性状态是胰岛素单体。注射用胰岛素溶液（10-3mo1/L）在中性情况下多数是与锌结合的六聚体。为了改进注射时胰岛素吸收速度，可以替换一些氨基酸残基，例如在二聚体接触面上换上具有相反电荷的残基，或是插入具有大的侧链氨基酸等方法，减少六聚体的形成。这样制备出的人胰岛素类似物，其吸收速度比可溶性野生型胰岛素要快得多。
五、基因靶向与转基因 DNA重组是基因靶向技术和转基因技术的重要手段。目前已迅速、广泛地应用于生物学及医学的基础研究、动物育种、植物品种改良、转基因药物等领域的研究。目前人们利用基因工程的方法已经获得了转基因抗虫棉、晚熟保鲜番茄、抗寒番茄、抗除草剂的玉米、油菜和大豆，以及品质优良、抗病、多产的转基因动物等。同时利用外源基因在哺乳动物体内的表达，可获得人类所需要的各种物质，如激素、抗体及疫苗等。
（张竞文） 习 题 一、选择题 A型选择题 1．下列各项中能说明外源目的基因完成了在受体细胞中表达的是（ ） A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA系列 D． 酵母菌中提取到人干扰素蛋白 E． PCR技术在白血病中检测到微量残留癌细胞 2．下列关于基因工程，错误的是（ ） A．目的基因和受体细胞均可来自动植物或微生物 B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性 D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞核促进目的基因的表达 E．在目前条件下，基因治疗只限于体细胞。
3． 有关PCR的说法，不正确的是（ ） A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 B．PCR技术的原理是DNA双链复制 C．PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 D．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA E．PCR的发展日新月异，有很多衍生的PCR技术 4．下列有关蛋白质工程的说法，正确的是（ ） A．蛋白质工程师在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作 B．蛋白质工程能产生出自然界不曾存在过的新型蛋白质分子 C．对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的 D．蛋白质工程的流程和天然蛋白质合成的过程是相同的 E．对蛋白质的定性定量分析可以揭示全基因组的表达活性 5．下列关于质粒的说法，不正确的是（ ） A．质粒广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中 B．质粒是一种双链环状DNA分子 C．具有多个限制性内切酶的多个位点 D．质粒可以便于外源基因的插入 E．质粒具有一个以上遗传标准，可对宿主细胞进行选择 6．下列哪一项不是基因克隆需要用到的工具酶（ ） A．DNA聚合酶I B． 逆转录酶 C． 碱性磷酸酶 D． 限制性内切酶 E．胰蛋白酶 7．关于常用克隆载体，不正确的是（ ） A．质粒是常用的载体 B．噬菌体经过重组可以携带外源DNA C．粘性质粒可以克隆较大的DNA片段 D．M13噬菌体适合克隆mRNA片段 E．病毒载体常用于将外源DNA带入哺乳动物细胞 8．可用于真核细胞转染的方法，不包括（ ） A．RT-PCR B．电穿孔法 C．脂质体介导法 D．DEAE葡聚糖法 E．显微注射法 9．关于cDNA文库 ，不正确的是（ ） A．目的基因可以从cDNA文库中获得 B．是以mRNA模板合成的互补DNA C．是特定状态下特定细胞的全部cDNA克隆 D．必须有高质量的DNA模板 E．cDNA文库比基因组文库小 10．下列哪项与重组DNA的筛选和鉴定无关（ ） A．采用抗性标记筛选细菌克隆 B．采用特定抗性基因失活进行筛选 C．磷酸钙共沉淀法筛选 D．酶切鉴定法 E．DNA测序法 X型选择题 1．不同目的的基因克隆需要不同的载体，常用的载体有（ ） A．质粒 B．噬菌体 C．粘性质粒 D．病毒 E．酵母菌 2．克隆基因的体外表达系统包括了（ ） A．大肠杆菌 B．哺乳动物细胞 C昆虫 D．病毒 E酵母菌 3．基因工程的步骤包括有（ ） A．制备目的基因和相关载体 B．将目的基因和载体连接 C．将重组DNA导入受体细胞 D．DNA重组体的筛选和鉴定 E．DNA重组体的扩增 4．用做克隆载体的噬菌体包括：
A．λ噬菌体 B．大肠杆菌 C．M13噬菌体 D．逆转录病毒 E．粘性质粒 5．哪些合适的策略可将DNA片段进行连接（ ） A．粘性末端适合DNA片段连接 B．人工接头处理不易连接的DNA片段 C．加入同聚物尾 D．将DNA片段导入感受态细胞 E．平端的DNA片段用连接酶连接 二、思考题 1．请举例说明利用重组DNA对基因进行定点诱变改造的实例。
2．简述基因克隆的基本过程步骤。
