姜珊 张建伟
【摘要】 目的：观察促排卵小鼠种植窗期子宫内膜成熟度及IL-6 mRNA表达。方法：选择健康性成熟昆明种雌性小鼠20只，随机数字表法分为观察组和空白组，检栓第4天（D4）比较两组小鼠子宫内膜成熟度及IL-6 mRNA表达。结果：观察组种植窗期子宫内膜成熟度低于空白组，差异有统计学意义（字2=5.051，P=0.025）;观察组IL-6 mRNA表达水平低于空白组，差异有统计学意义（t=-2.164，P=0.044）。结论：促排卵小鼠种植窗期子宫内膜发育较正常小鼠延迟，成熟度及IL-6 mRNA表达降低。
【关键词】 小鼠 促排卵 子宫内膜 种植窗期 白细胞介素-6
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.27.061 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2020）27-0-02
[Abstract] Objective：
To observe the endometrial maturity and the expression of IL-6 mRNA in the implantation window of ovulation promoting mice. Method：
Twenty healthy and sexually mature Kunming mice were selected， and were randomly divided into the experimental group and the blank group. The mice were killed off in the morning of the 4th day （D4） after being found having vaginal suppository. The endometrial maturity and the expression of IL-6 mRNA were compared. Result：
The endometrial maturity in the observation group was lower than that in the blank group， the difference was statistically significant （字2=5.051， P=0.025）. The expression level of IL-6 mRNA in the observation group was lower than that in the blank group， the difference was statistically significant （t=-2.164， P=0.044）. Conclusion：
The development of endometrium is delayed， the maturity and the expression of IL-6 mRNA are decreased when ovulation promoting mice are at implantation window.
[Key words] Mice Ovulation induction Endometrium Implantation window IL-6
First-authors address：
Shandong First Medical University， Jinan 250062， China
围着床期子宫内膜对胚胎的容受性是生殖领域的研究热点。助孕治疗应用的各种促排卵药物，使人体内环境失衡，可能对子宫内膜的容受性存在负面影响[1-4]。本研究观察促排卵药物对小鼠围着床期子宫内膜组织形态及白细胞介素-6（Interleukin- 6，IL-6）mRNA的表达变化，为促排卵临床方案优化提供参考，具体如下。
1 材料与方法
1.1 一般材料
1.1.1 实验动物 选取SPF（specific pathogen free）級昆明种雌性小鼠（山东大学实验动物中心）20只，雄性小鼠10只，8～9周龄，体重（35±5）g。
1.1.2 药物 注射用尿促性素（human menopausal gonadotropin，HMG，丽珠集团丽宝生物化学制药公司，75 IU/支，国药准字H10940097）;注射用人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG，丽珠集团丽宝生物化学制药公司，2 000 U/支，国药准字H44020674）。
1.1.3 试剂 梯度酒精（75%、80%、95%、100%）、苏木素-伊红液、10%中性甲醛液、二甲苯、中性树胶、去RNase水、2 mol/L NaOAc（pH=4.0）、MMLV逆转录酶200 U/μl、逆转录反应体系（RT reaction buffer）、Taq DNA聚合酶1 U/μl、PCR反应体系（PCR reaction buffer）、GIT变性液、1.5%琼脂糖凝胶。
1.1.4 实验仪器 眼科手术器械、体视镜（LEICA GZ6）、-80 ℃超低温冰箱（日本SANYO）、倒置显微镜（OLYMPAS CK 40-32ph）、脱水机（ZT-12P）、展片机（ZPJ-1A）、XK96-A型快速混匀器（江苏省新康仪器厂）、EC250-90多功能电泳仪（EC公司）、PTC-150型PCR扩增仪（美国MJ Research公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 20只雌性小鼠按随机数字表分为观察组和空白组，每组10只。每笼5只饲养。饲养室温度20 ℃～22 ℃，相对湿度50%，控制12 h光照，12 h黑暗。
1.2.2 给药方法 参照文献[5]建立促排卵小鼠模型，以HMG/HCG联合方案进行。连续观察2个动情周期后，于上午9点行阴道涂片检查为动情前期，观察组于下午6点腹腔注射HMG 12 IU，空白组给予等量生理盐水，48 h后观察组小鼠腹腔注射HCG 12 IU，空白组仍给予等量生理盐水。观察组与空白组雌性小鼠均按雌∶雄=2∶1合笼饲养，待检查雌性小鼠陰道出现阴栓时即为交配成功，此时对雌性小鼠进行标本采集，雄性小鼠则不参与后续标本制作。
1.2.3 标本采集 合笼次晨查有阴栓作为妊娠第1天（D1），检栓第4天（D4）于上午9点脱颈处死小鼠，取出子宫角，修去宫颈。一侧宫角置10%中性甲醛溶液中，石蜡包埋，切片厚度4 μm;挤压法分离另一侧子宫内膜，置液氮中，转移到-80 ℃超低温冰箱待检。
1.2.4 小鼠子宫内膜成熟度比较 光学显微镜检测小鼠子宫内膜组织，根据内膜厚度、间质疏松程度、血管及腺体形态学特征判断子宫内膜成熟度，观察组及空白组进行比较。
1.2.5 小鼠子宫内膜IL-6 mRNA表达测定 采用RT-PCR
测定子宫内膜IL-6 mRNA的表达。根据基因序列，参照MEDLINE PubMed nucleotide query进行合成。IL-6引物序列：上游为5-TTGACAAACAAATTCGGTACA-3;下游为5-GAGGTGCCCATGCTACA-3;β-actin引物序列：上游为5-ATGGGTCAGAAGGACTCCTA-3，下游为5-ACGCTCGGTCAGGATCTTCAT-3。取子宫内膜组织约100 mg，加入1 ml Trizol试剂，匀浆器充分匀浆，参照说明书提取总RNA。RT-PCR扩增条件：94 ℃ 1 min;58 ℃ 1 min;72 ℃ 1 min;共35个循环，其后72 ℃延长7 min。经琼脂糖凝胶电泳，扩增产物通过凝胶成像分析系统摄像测量，分析条带灰度值，以IL-6 mRNA与内参照β-actin mRNA的光密度值（IOD）的比值作为目的基因mRNA的相对表达量。
1.3 统计学处理
应用SPSS 22.0软件包行统计处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验;计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组种植窗期子宫内膜成熟度比较
观察组小鼠子宫内膜发育成熟者3只，发育延迟者7只;空白组小鼠子宫内膜发育成熟者8只，发育延迟者2只。观察组种植窗期子宫内膜成熟度低于空白组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 两组促排卵小鼠种植窗期子宫内膜IL-6mRNA表达比较
观察组小鼠子宫内膜IL-6 mRNA表达水平为0.45±0.15，空白组小鼠子宫内膜IL-6 mRNA表达水平为0.61±0.17。观察组IL-6 mRNA表达水平低于空白组，差异有统计学意义（t=-2.164，P=0.044）。
3 讨论
子宫内膜容受性是胚胎植入的重要保证，胚胎与子宫内膜具有高度的时空特异性。借助定位、黏附、穿透过程，胚胎才能在子宫内膜着床，而只有建立了容受性的种植窗内膜才能接受胚胎植入[5-6]。促排卵作为助孕技术的重要环节，使患者获得多个可利用的卵子成为可能，临床治疗方案发展日新月异，然而种植率并不理想。研究表明，诱导排卵药物的应用，对内膜有不同程度的负面影响，直接或间接干扰内膜发育，并与胚泡发育不同步，而子宫内膜容受状态的改变，与种植窗内膜组织形态和相关分子水平变化有关，从而对助孕治疗结局产生影响[7-8]。人IL-6分子量为21～26 kD，由184个氨基酸组成，是一种重要的多功能细胞因子，能促进细胞增殖、黏附，是炎症反应的敏感标记物，同时也是子宫内膜种植窗期的重要的分子标志物[9]。研究证实，不明原因不孕女性的子宫内膜IL-6水平降低[10]。孕早期小鼠腹腔注射不同剂量的IL-6对小鼠子宫内膜中白血病抑制因子（leukemia inhitory factor，LIF）mRNA及蛋白水平均有显著上调作用，作用呈剂量依赖性，鉴于IL-6的生物学特性及其在胚泡着床过程中的特异表达，它可能通过旁/自分泌作用参与子宫内膜容受性的调节[11-12]。
本研究显示HMG促排卵小鼠光镜下内膜腺体和间质发育非同步化，部分腺腔直而窄，甚至缺乏应有的腺腔，内膜成熟度明显延迟，与空白组小鼠比较差异有统计学意义（P<0.05），且子宫内膜IL-6 mRNA表达低于空白组，差异有统计学意义（P<0.05）。提示HMG促排卵对小鼠种植窗期子宫内膜发育存在不良影响，这可能是临床促排卵治疗出现高排卵率低妊娠率的原因之一。
综上所述，借助小鼠动物实验，由分子水平探讨促排卵对子宫内膜成熟度及IL-6 mRNA表达的影响，为促排卵下的胚泡着床机制提供依据。然而胚胎着床影响因素繁杂，IL-6在子宫内膜的定位及相关的通信网络及信号通路有待深入研究。
参考文献
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（收稿日期：2020-04-01） （本文编辑：马竹君）
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