阿尼古力·沙比尔?甄雅惠?付玉霞?盛娟?阿依努尔·斯迪克?李瑞岐
【摘要】目的 研究白蘆藜醇（RSV）对小鼠超排卵效果及胚胎发育的影响。方法 以2～3月龄的CD-1小鼠为研究对象，在超排卵同时腹腔注射RSV（RSV组）或二甲基亚砜（DMSO组），观察RSV对小鼠超排卵子质量的影响。选取了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、卵巢和睾丸组织的模板DNA，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分别检测沉默信息调节因子（SIRT1） mRNA在这三者中的表达情况。另外获取小鼠P1卵丘细胞，设置DMSO组、RSV（1 μmol/L）组和EX-527（SIRT1的抑制剂，10 μmol/L）组，使用荧光免疫染色检测各组SIRT的相对荧光强度、qRT-PCR检测各组的mtDNA相对表达量。结果 RSV组的卵裂率和囊胚率均高于DMSO组（P均< 0.05）。体外实验结果显示，SIRT1 mRNA的相对表达量在卵巢是MEF的15～25倍（P < 0.001）。小鼠P1卵丘细胞在经RSV处理后SIRT1荧光相对强度升高（P < 0.001）。在用RSV和EX-527分别处理小鼠卵丘细胞48 h后，RSV组mtDNA相对表达量高于DMSO组（P < 0.001），而EX-527组mtDNA相对表达量低于DMSO组（P < 0.01）。结论 小鼠超排卵时补充RSV能够显著改善卵子的发育潜能。
【关键词】白藜芦醇;线粒体;线粒体DNA;卵子质量;辅助生殖技术
Effect of resveratrol on the quality of oocytes after superovulation in mouse models Aniguli·Shabier， Zhen Yahui， Fu Yuxia， Sheng Juan， Ayinuer·Sidike， Li Ruiqi. Reproductive Medicine Center， the First Peoples Hospital of Kashgar， Kashgar 844000， China
Corresponding author， Li Ruiqi， E-mail：
wxszzx@ 163. com
【Abstract】Objective To evaluate the effect of resveratrol （RSV） on the superovulation and embryonic development in mouse models. Methods In this study， CD-1 mice （2-3 months old） were selected. RSV （RSV group） or dimethyl sulfoxide （DMSO group） was injected intraperitoneally during superovulation to observe the effect of RSV on the quality of superovulated oocytes in mice. Template DNA of mouse embryonic fibroblasts （MEF）， ovary and testis tissues was extracted. The expression level of SIRT1 mRNA in these three tissues was detected by quantitative PCR. In addition， mouse P1 cumulus cells were obtained and divided into the DMSO， RSV （1μmol/L） and EX-527 （10 μmol/L inhibitor of SIRT1） groups. The relative fluorescence intensity of SIRT in each group was detected by immunofluorescence staining. The relative expression of mtDNA in each group was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The cleavage rate and blastocyst rate in the RSV group were significantly higher than those in the control group （both P < 0.05）. The results of in vitro experiments showed that the relative expression of SIRT1 mRNA in the ovary was 15-25 times of that in the MEF （P < 0.001）. The relative fluorescence intensity of SIRT1 in the P1 mouse cumulus cells was significantly increased after RSV treatment （P < 0.001）. After the mouse cumulus cells were treated with RSV and SIRT1 inhibitor （EX-527） for 48 h， the relative expression level of mtDNA in the RSV group was significantly higher than that in the DMSO group （P < 0.001）， whereas the relative expression level of mtDNA in the EX-527 group was significantly lower compared with that in the DMSO group （P < 0.01）. Conclusion RSV supplementation during superovulation can significantly improve the developmental potential of oocytes in mouse models.
【Key words】Resveratrol;Midtochondria;mtDNA;Oocyte quality;Assisted reproductive technique
改善卵子质量，提高胚胎发育潜能一直是辅助生殖技术（ART） 所追求的目标。近年来，越来越多的研究显示，线粒体功能下降是造成卵子质量下降的重要原因。白藜芦醇 （RSV）又称为芪三酚，是一类增强线粒体功能的药物。有研究显示，在卵母细胞体外成熟 （IVM） 时补充 RSV能够提高胚胎的囊胚率[1]。超排卵过程是卵泡快速生长的时期，也是卵母细胞内的线粒体和线粒体DNA（mtDNA）快速增殖的时期[2]。在此时补充 RSV会对超排卵产生什么样作用，笔者尚未见有相关报道。为此，本研究在小鼠超排卵同时补充RSV，观察其对超排效果的影响，并初步探讨其可能的作用机制，现报告如下。
材料与方法
一、实验动物
本实验所用小鼠为CD-1品系，超排卵实验为12只2 ～ 3月龄的雌性小鼠，体质量约30 g。获取颗粒细胞所用小鼠为1月龄小鼠，体质量约20 g。用于交配的雄鼠为4 ～ 5月龄，体质量约50 g。本研究所用小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，所有实验动物的饲养及操作均符合实验动物伦理相关要求。
二、主要试剂和仪器
主要试剂孕马血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）购自宁波三生药业，二甲基亚砜（DMSO）、RSV、EX-527购自美国Sigma公司，KSOM坯胎培养液购自美国Millopore公司，荧光定量检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技股份有限公司，沉默信息调节因子（SIRT1）一抗购自美国Santa Cruz公司，Alexa Fluor 555标记驴抗小鼠IgG、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG、OCT4一抗购自上海碧云天生物技术有限公司。主要仪器包括罗氏LightCycler 480实时荧光定量 PCR 仪、奥林巴斯CKX41倒置荧光显微镜。本研究中的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
三、小鼠超排方案及2-细胞期胚胎的获取
12只雌性小鼠按随机数表法分配到对照组（DMSO组）和实验组（RSV组），每组6只小鼠，每只小鼠均予腹腔注射5 IU的PMSG。在此基础上，对照组注射稀释过的DMSO，实验组注射RSV 20 mg/kg，该计量参考Park等[3]的研究。48 h后，2组小鼠均注射5 IU的HCG，同时对照组和实验组分别再次注射相同剂量的DMSO和RSV。小鼠在注射后与成年雄鼠1∶1合笼。合笼的次日上午8∶00检查是否交配成功，阴道口有精栓者（见栓）视为交配成功，交配成功的雌性小鼠和未交配成功的雌性小鼠分笼放置。交配成功30 h后取雌性小鼠的输卵管进行冲胚。收集从输卵管冲出的2-细胞期胚胎和未受精的卵母细胞进行统计，将2-细胞期的胚胎放入预平衡好的KSOM胚胎培养液中进行培养，培养至囊胚阶段（D4）。囊胚评分参考文献[4]的标准，滋养层细胞完整、内细胞团明显的囊胚为优质囊胚。
四、SIRT1在小鼠睾丸和卵巢组织中的表达检测
本实验室前期制备了CD1小鼠多个器官组织的模板DNA（cDNA），本研究选取了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、卵巢和睾丸组织的cDNA，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分别检测SIRT1在这三者中的表达情况。
五、原代小鼠卵丘细胞的获取及培养
1月龄CD1雌性小鼠注射PMSG 48 h后获取卵巢组织，用1 ml注射器针头在体视显微镜下刺破卵泡，获取未成熟的卵丘卵母细胞复合体（COC），之后用剥卵针将卵丘细胞剥掉，收集操作液并离心洗涤，最后将卵丘细胞接种到6孔板内培养，此时卵丘细胞为P0代，培养基为DMEM/F12+10%胎牛血清。卵丘细胞长满整个培养板后，按1∶3传代（P1） [5]。小鼠P1卵丘细胞传代12 h
后，各组加入相应的处理药物培养48 h。
六、mtDNA mRNA相对定量
为了验证SIRT1在卵丘细胞中对线粒体增殖的作用，本研究设置3组，分别为DMSO组、RSV（1 μmol/L）组和EX-527（SIRT1的抑制剂，10 μmol/L）组，每组设置2个复孔，小鼠P1卵丘细胞处理48 h后通过qRT-PCR检测各组mtDNA相对表达量。β-Globin引物：正向5-CGAACATACTGAACTGCTA-3，反向5-GACATATCTGACATCT CTACTT-3，产物长度为106 bp。mtDNA
引物：正向5- TACCTCACCATCTCTTGCTA-3，反向5-GCTACACCTTGACCTAACG-3，产物长度为114 bp。以总DNA为模板，β-Globin为内参，按照qRT-PCR试剂盒说明书进行操作[5]。根据公式2-△△Ct进行mtDNA相对量的计算，目的基因相对表达量用目的基因与β-Globin 之比表示。
七、荧光免疫染色
具体过程参考既往文献报道：使用SIRT1一抗与小鼠P1卵丘细胞进行共孵育，然后使用Alexa Fluor 555驴抗小鼠IgG进行标记、OCT4抗体特异性识别囊胚内细胞团细胞，再用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG进行标记，最后用DPAI对所有囊胚细胞的细胞核进行染色，在倒置荧光显微镜下进行囊胚细胞计数[5]。SIRT1的荧光强度定量采用ImageJ软件分析灰度值，结果以实验组与对照组的相对值（对照組设为1）表示。实验重复3次，结果取平均值。
八、统计学处理
采用SPSS 21.0进行数据分析。计量资料以表示，2组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析，多重比较行Dunnet-t检验。计数资料以率表示，采用Pearson χ2检验分析组间差异。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
一、RSV对小鼠自然受精胚胎发育的影响
小鼠的超排卵结果显示，DMSO组和RSV组各有4只和6只小鼠见栓，取得RSV组2-细胞期胚胎和未受精（未卵裂）的卵母细胞共140枚，对照组2-细胞期胚胎和未受精（未卵裂）的卵母细胞共82枚，RSV组的卵裂率和囊胚率均高于DMSO组（P均< 0.05）。2组优质胚胎率和囊胚细胞数比较差异无统计学意义（P均> 0.05），见表1、图1。
二、SIRT1 mRNA在生殖细胞组织内的表达情况
RSV的作用基因为SIRT1，为了检测该基因对生殖细胞的作用，本研究以SIRT1在MEF中的表达量为对照，检测SIRT1在卵巢和睾丸组织内相对于MEF的表达情况。结果显示，SIRT1 mRNA在MEF、卵巢和睾丸组织中的相对表达量比较差异有统计学意义（F = 1303.958，P < 0.001）。其中，SIRT1 mRNA的相对表达量在卵巢是MEF的15 ～ 25倍（P < 0.001），提示SIRT1在卵巢中可能有重要的生物学作用，见图2。
三、添加RSV对体外培养小鼠卵丘细胞SIRT1表达及mtDNA相对表达量的影响
为了观察RSV对卵丘细胞SIRT1表达的影响，本实验使用RSV处理P1代小鼠卵丘细胞48 h，
通过免疫染色对比SIRT1在RSV组和DMSO组中的表达情况。结果显示，添加RSV后可提高SIRT1在卵丘细胞中的表达（t = -16.913， P < 0.001），见图3A、B。进一步使用RSV和SIRT1抑制剂EX-527分别处理P1代小鼠卵丘细胞48 h，
然后检测各组的mtDNA的相对表达量，结果显示3组mtDNA相对表达量比较差异有统计学意义（F = 114.416，P < 0.001），其中EX-527 组的mtDNA相对表达量低于DMSO组（Dunnet-t = 5.899，P = 0.002），而RSV 组的mtDNA相对表达量高于DMSO组（Dunnet-t = 9.113，P < 0.001），见图3C。
讨论
卵母细胞质量是辅助生殖技术助孕成败的关键因素，不仅影响胚胎的早期发育，甚至对后代的健康也会产生重大影响。高龄女性和卵巢储备下降（DOR）患者的卵母细胞mtDNA拷贝数显著低于年轻和非DOR患者卵母细胞的拷贝数。此外，胚胎的代谢情况也会有所改变[7]。低mtDNA量的卵母细胞产生的胚胎可能会在胚胎种植前激活mtDNA的复制，以补偿卵母细胞mtDNA的不足，而这部分胚胎多数表现为染色体异常或者种植失败[8]。近来越来越多的研究显示，改善线粒体功能能够提高卵子质量，甚至可以逆转年龄对卵子质量的影响[10-11]。因此，提高卵母细胞线粒体的功能将成为改善卵子质量的有力措施。
近来有研究显示，RSV能够提高人及小鼠IVM卵母细胞纺锤体的完整性，降低染色体的异常率，并能够抵抗卵子体外的老化过程[12-14]。Liu等[15]研究显示，对小鼠长期喂食RSV能够降低卵母细胞的非整倍体率，并延长小鼠的繁殖期限。卵泡快速生长的时期也是卵母细胞内的线粒体和mtDNA 快速增殖的时期，在补充RSV是否会改善超排卵子的发育潜能尚未有文献对此进行报道。本研究在小鼠卵泡启动和扳机时分别给予1次RSV刺激，结果显示在此时补充RSV能提高小鼠胚胎体外培养的囊胚形成率。优质囊胚率和平均囊胚细胞数组间比较差异无统计学意义，原因可能是RSV组卵裂的胚胎显著增多，這些卵裂的胚胎中含有发育为优质囊胚的比例可能会被拉低;而DMSO组质量不好的卵子可能不发生卵裂提前被淘汰了，从而含有高质量卵裂胚胎的比例会相应增加，最终导致优质囊胚率在组间比较差异无统计学意义。虽然2组的优质囊胚率和囊胚细胞数相近，但是RSV处理后明显改善了胚胎发育到囊胚的能力，因此我们认为超排卵时补充RSV能够提高胚胎的发育潜能。另外，超排卵过程是卵泡快速生长的过程，卵母细胞内的线粒体数量和mtDNA也在此时期快速增殖，因此我们选择在此时补充RSV。但是在超排卵之前提前使用，延长使用时间以及改变剂量是否会产生不同的影响，还需要进一步研究。
RSV能够通过SIRT1激活PGC-1α的活性，PGC-1α进一步激活线粒体增殖相关基因的表达，增强线粒体的功能，并促进mtDNA拷贝数的增加[3]。本研究显示，SIRT1在小鼠卵巢和睾丸细胞中高表达（与小鼠成纤维细胞相比），说明SIRT1在生殖细胞中有重要的作用。通过在体外培养小鼠卵丘细胞过程中添加RSV，我们发现RSV能够显著提高卵丘细胞中SIRT1和mtDNA的表达量，而卵丘细胞mtDNA表达量与卵母细胞mtDNA表达量和卵母细胞的质量密切相关[16-18]。由此推测，在体内补充RSV能够通过激活SIRT1基因的表达，并可能通过PGC-1α进而诱导线粒体的增殖，改善卵母细胞的质量。
综上所述，本研究初步证实在超排卵时补充RSV能够改善小鼠超排卵子的质量，提高胚胎发育潜能，但是能否在人ART中产生相似的效果还需要进一步研究。
参 考 文 献
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（收稿日期：2021-02-08）
（本文編辑：林燕薇）
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