袁宇慧
[摘要] 目的 探讨HBeAg阳性及阴性患者血清HBV RNA水平对乙肝相关肝纤维化的影响，为早期肝纤维化诊断和预测提供新方案。
方法 选取2016年10月至2019年9月我院确诊的乙肝病毒感染的患者145例作为研究对象，进行HBV DNA、HBV RNA水平的检测;通过肝活检及相关生化指标评定肝纤维化分级、炎症分级和肝脏储备能力;通过多因素Logistic回归分析，明确独立危险因素;通过ROC曲线评价HBV RNA水平对乙肝相关肝纤维化预测的影响。
结果 HBeAg阳性患者的AST、ALT和 HBV DNA定量均顯著高于HBeAg阴性患者，差异有统计学意义（P<0.05）;在HBeAg阳性和阴性患者中，HBV RNA阳性组的肝纤维化分级、炎症分级和Child-Pugh分级均显著高于HBV RNA阴性组，差异有统计学意义（P<0.05）;多因素Logistic回归分析显示，HBeAg阳性和阴性患者的肝纤维化分级、炎症分级和Child-Pugh分级是影响HBV RNA的独立危险因素（P<0.05）;ROC曲线和效能评估检测发现，HBV RNA评估HBeAg阴性患者肝纤维化分级和炎症分级的曲线下面积（AUC）分别为0.721和0.763，特异度分别为69.5%和73.5%，敏感度为73.8%和75.4%。
结论 HBV RNA与乙肝肝纤维化具有相关性，对HBeAg阴性患者具有预测价值，值得临床推广。
[关键词] HBV RNA;肝纤维化;HBeAg;相关性分析
[中图分类号] R512.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）08-0001-05
Analysis on the correlation between serum HBV RNA level and hepatitis B related hepatic fibrosis in HBeAg positive and negative patients
YUAN Yuhui
Department of Hepatology， Xuzhou Infectious Disease Hospital in Jiangsu Province， Xuzhou 221000， China
[Abstract] Objective To investigate the impacts of serum hepatitis B virus（HBV） RNA level and hepatitis B related hepatic fibrosis in HBeAg positive and negative patients， and to provide a new scheme for early diagnosis and prediction of hepatic fibrosis. Methods A total of 145 patients with confirmed HBV infection from October 2016 to September 2019 were selected as the research objects， and HBV DNA and HBV RNA levels were detected. The levels of fibrosis， inflammation and liver reserve capacity were evaluated by liver biopsy and related biochemical indexes. Through multivariate Logistic regression analysis， the independent risk factors were identified. ROC curve was used to evaluate the impacts of HBV RNA level on the prediction of hepatitis B related hepatic fibrosis. Results The levels of AST， ALT and HBV DNA in HBeAg positive patients were all significantly higher than those in HBeAg negative patients， with statistically significant differences（P<0.05）. In HBeAg positive and negative patients， the levels of hepatic fibrosis， inflammation and child-pugh in the HBV RNA positive group were significantly higher than those in the HBV RNA negative group， with statistically significant differences（P<0.05）. It was shown by multivariate Logistic regression analysis that the levels of hepatic fibrosis， inflammation and child-pugh were independent risk factors of HBeAg positive and negative patients impacting HBV RNA（P<0.05）. It was shown by ROC curve and efficacy evaluation that the area under the curve（AUC） of HBV RNA in evaluating the levels of hepatic fibrosis and inflammation in HBeAg negative patients was 0.721 and 0.763， the specificity was 69.5% and 73.5%， and the sensitivity was 73.8% and 75.4%（P<0.05）. Conclusion HBV RNA is correlated with hepatitis B hepatic fibrosis， and has predictive value for HBeAg negative patients， which is worthy of clinical promotion.
[Key words] HBV RNA; Hepatic fibrosis; HBeAg; Correlation analysis
慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是重要的公共卫生问题，极大程度地危及人们的生命财产安全[1]。慢性乙肝病毒感染患者具有很高的进展性肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的风险。因此，肝纤维化或肝硬化的早期诊断和严重程度评估对控制病情进展起着重要作用，有利于降低HBV感染相关终末期肝病的发病率和死亡率。现如今，肝组织活检是诊断肝纤维化或肝硬化的金标准，但由于肝组织活检作为一种有创检测，具有诸多局限性，如患者配合度较差、取样标本大小位置差异性较大等[2]，所以更便捷、无创的评估乙肝肝纤维化患者病情的方法是临床上迫切需要的。有研究表明，乙肝相关肝纤维化或肝硬化患者的血清HBV DNA处于低浓度状态，但与肝纤维化密切相关的共价闭合环状DNA（cccDNA）浓度仍较高，且复制活跃。由于肝组织内cccDNA分布不均及血清内双链DNA干扰，cccDNA的肝组织和血清检测难度大。血清HBV RNA作为cccDNA的直接转录体，能准确反映cccDNA水平[3]。因此，本研究探讨血清HBV RNA水平与乙肝肝纤维化患者病情、肝纤维化程度及肝脏炎症的关系及其对乙肝肝纤维化诊断价值评估，为提高临床诊断提供新的研究基础，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2016年10月至2019年9月间我院收治的乙肝肝纤维化患者145例作为研究对象。年龄25～69岁，平均（48.49±9.55）歲。男97例，女48例。根据乙肝e抗原（HBeAg）携带情况分为HBeAg阳性组71例和HBeAg阴性组74例。纳入标准：①患者符合2019年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》[4]，并分为无明显肝纤维化期（S0～S1）和明显纤维化期（S2～S4）;②临床资料完整者。排除标准：①药物性肝病、酒精性肝病或其他病因导致的肝纤维化或肝硬化者;②具有其他原因导致的肝损伤者;③合并恶性肿瘤或免疫系统疾病者;④伴有严重心、肺、肾等慢性疾病者;⑤昏迷或存在精神障碍者。本研究通过我院医学伦理委员会审批，所有入组患者均知情并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 血清HBV DNA和RNA检测 采用COBAS Taqman HBV DNA载量试剂盒（罗氏Cobas，瑞士）检测HBV DNA;采用HBV-pgRNA核酸检测试剂盒（PerkinElmer公司，美国），通过核酸提取、反转录、扩增等过程检测HBV RNA，操作均严格按照说明书执行。根据试剂盒检测的下限，将检出者称为阳性，未检出者称为阴性。
1.2.2 肝穿刺活检及纤维化和炎症分级 患者在超声引导下进行肝穿刺，采用全自动一次性穿刺针（BARD，美国），取15～20 mm病理标本，常规石蜡切片后，行HE、Masson和网织纤维染色。由两名病理科医师双盲阅片，根据2015年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》标准将肝组织病理切片纤维化程度分为无明显肝纤维化期（S0～S1）和明显纤维化期（S2～S4）;将肝组织病理切片根据炎症程度分为轻度慢性肝炎（G1/G2期）和中、重度慢性肝炎（G3/G4期）。
1.2.3 血清生化及血清学指标的检测 患者清晨空腹抽血2～3 mL，4000 rpm离心10 min，分离血清，于-80℃保存。使用C701全自动生化分析仪（罗氏Cobas，瑞士）检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）;采用ARCHITECTi2000SR（雅培ABBOTT，美国）经化学发光法检测HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb和HBcAb，操作规程严格按照试剂盒说明书执行。
1.2.4 肝脏储备功能评价 采用Child-Pugh分级标准对肝纤维化或肝硬化患者的肝脏储备功能进行量化评估，根据腹水、总胆红素、清蛋白、凝血酶原时间、肝性脑病分期将患者分为A级（5～6分，肝脏储备功能较好）、B级（7～9分，肝脏储备功能一般）和C级（≥10分，肝脏储备功能较差）。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验;计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验;采用多因素Logistic回归分析HBV RNA的影响因素;采用ROC曲线评估HBV RNA的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HBeAg阳性与阴性乙肝患者一般资料与临床指标比较
HBeAg阳性与阴性患者的年龄、性别、TBIL、DBIL和IBIL比较，差异无统计学意义（P>0.05）;HBeAg阳性患者的肝功能指标AST、ALT和 HBV DNA定量均显著高于HBeAg阴性患者，差异有统计学意义（P<0.05）;然而，HBeAg阳性患者的HBV RNA定量显著低于HBeAg阴性患者，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 HBeAg阳性与阴性患者生化指标、纤维化分级、炎症分级和肝脏储备能力在HBV RNA阳性组和阴性组比较
HBeAg阳性患者中，HBV RNA阳性组与HBV RNA阴性组AST、ALT、HBV DNA阳性率水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），HBV RNA阳性组的肝纤维化分级、炎症分级和Child-Pugh分级显著高于HBV RNA阴性组，差异有统计学意义（P<0.05）。HBeAg阴性患者中，HBV RNA阳性组AST、ALT、HBV DNA阳性率、肝纤维化分级、炎症分级和Child-Pugh分级均显著高于HBV RNA阴性组，差异有统计学意义（P<0.01）。
2.3 影响HBeAg阳性与阴性患者HBV RNA的多因素Logistic回归分析
以HBV RNA为因变量（y：HBV RNA阴性组=0，HBV RNA阳性组=1），以单变量分析中P<0.10的因素为自变量，进行变量赋值后，纳入患者进行回归分析。Logistic回归分析显示，在HBeAg阳性患者中，肝纤维化分级[OR=1.885，95%CI：1.245～2.673]、炎症分级[OR=2.228，95%CI：1.725～2.518]和Child-Pugh分级[OR=2.046，95%CI：1.508～2.529]是HBV RNA的独立危险因素（P<0.05）;在HBeAg阴性患者中，AST[OR=1.830，95%CI：1.526～2.238]、ALT[OR=1.682，95%CI：1.238～2.025]、HBV DNA阳性率[OR=1.772，95%CI：1.215～2.204]、肝纤维化分级[OR=2.374，95%CI：1.734～2.945]、炎症分级[OR=2.058，95%CI：1.663～2.497]和Child-Pugh分级[OR=2.337，95%CI：1.823～2.852]是HBV RNA的独立危险因素（P<0.05）。
2.4 HBeAg阳性与阴性患者HBV RNA对肝纤维化分级和炎症分级的评价效能分析
分析HBeAg阳性与阴性患者的HBV RNA对肝纤维化分级和炎症分级进行评估，绘制ROC曲线。见图1。在HBeAg阳性患者中，HBV RNA评估肝纤维化分级和炎症分级的曲线下面积（AUC）分别为0.633和0.606，特异度分别为43.6%和49.7%，敏感度為51.5%和47.3%（P>0.05）;在HBeAg阴性患者中，HBV RNA评估肝纤维化分级和炎症分级的曲线下面积（AUC）分别为0.721和0.763，特异度分别为69.5%和73.5%，敏感度为73.8%和75.4%（P<0.05）。
3 讨论
乙型肝炎病毒感染是导致慢性肝纤维化[5]、肝硬化[6]甚至肝癌[7]的主要病因之一，因此乙肝病毒感染后肝纤维化预防和病情评估十分重要。抗HBV治疗有效的标准是血清学的转换，其中HBeAg由阳转阴具有重要意义[8]。然而有研究发现，HBeAg阴性患者仍可能继发肝纤维化或肝硬化，这是由于在长期HBV感染中，患者可能对野生型HBV复制的耐受性降低，进而导致HBeAg转阴，但HBV DNA可转化为cccDNA，仍复制活跃[9]。乙肝肝纤维化是肝脏对因乙肝肝炎病毒引起的慢性炎症损伤进行修复和愈合的结果，肝脏结构被破坏、改建中形成假小叶[10]，最终引起肝功能障碍、肝硬化和肝癌，因此乙肝病毒的长期活跃与肝纤维化密不可分。HBV RNA作为HBV未经逆转录的前基因组，可有效反映乙肝患者肝细胞内cccDNA的水平和转录活性，因此可能成为乙肝疗效评价或乙肝肝纤维化预测的潜在指标[11]。
为明确HBV RNA对乙肝患者肝纤维化的作用，本研究根据HBeAg阳性/阴性将患者分为两组，首先比较两组间生化指标的差异，发现HBeAg阳性组AST、ALT和 HBV DNA定量均显著高于HBeAg阴性组（P<0.05），但HBV RNA定量显著低于HBeAg阴性组（P<0.05）。这种HBV DNA和RNA的差异型趋势的原因可能是HBV DNA在抗病毒治疗后可受到反转录抑制，HBeAg由于耐受转阴，进而导致HBV DNA检测数值降低，但HBV仍以cccDNA的形式不断产生HBV RNA病毒样颗粒，因此HBeAg阴性患者的HBV RNA仍居高不下[12]。彭亚梦等[13]研究发现，HBeAg阳性/阴性的HBV DNA与HBV RNA水平存在较大差异，HBeAg是CHB患者血清HBV RNA水平的影响因素，但HBeAg与HBV DNA不相关，提示相较于HBV DNA，HBV RNA能更好地反映HBeAg的转阴情况。
本研究为探讨HBV RNA在HBeAg阳性/阴性情况下对乙肝相关肝纤维化的影响，比较HBV RNA阳性组和阴性组间AST、ALT、HBV DNA、肝纤维化分级、炎症分级和肝脏储备能力的差异，发现HBeAg阳性/阴性情况下，HBV RNA阳性组的肝纤维化分级、炎症分级和Child-Pugh分级均显著高于HBV RNA阴性组，提示HBV RNA可能与乙肝肝纤维化存在相关性。之后通过多因素Logistic回归分析发现，HBeAg阳性患者的肝纤维化分级、炎症分级和Child-Pugh分级是HBV RNA的独立危险因素;HBeAg阴性患者的AST、ALT、HBV DNA阳性率、肝纤维化分级、炎症分级和Child-Pugh分级是HBV RNA的独立危险因素。最后通过ROC曲线对HBV RNA预测肝纤维化进行研究发现，HBV RNA对HBeAg阴性患者肝纤维化的预测特异度和敏感度较好，提示HBV RNA对乙肝患者的肝纤维化具有评估作用，尤其是在HBeAg转阴的患者中，HBV RNA的预测效能较高。这种情况的出现可能与乙肝的治疗方法有关，目前核苷类药物是乙肝活动期的主要治疗手段，其对HBV DNA的抑制作用十分明显，但对cccDNA作用有限，需要更长时间的持续用药。蒋贝等[14]研究认为，在HBeAg阴性患者中血清HBV RNA仅来源于cccDNA的直接转录，故较HBV DNA和HBsAg更能反映cccDNA水平或活性，因此可以作为HBV转录活性的评价指标。另一项研究认为，HBV RNA持续阴性可作为部分治愈的依据，对预测停药后复发或病毒学反弹风险具有意义[15]。Liu等[16]也认为HBV RNA可以反映肝纤维化程度，且具有较好的HBV转录活性评价效能，可以作为一种新的乙肝治疗停药指标。
综上所述，HBV RNA与乙肝肝纤维化具有相关性，尤其是在HBeAg阴性患者中，HBV RNA具有乙肝肝纤维化的较好预测效能，但本研究病例数较少，对于肝纤维化各期HBV RNA变化仍需进一步大样本量的前瞻性研究。
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