郑益平 陈坚 朱炳耀
摘要：【目的】精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸酶（metacaspases，MCs）在植物生长发育的细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）中发挥重要的调控作用，为系统鉴定草莓FaMC基因家族，进行草莓FaMC基因家族全基因组鉴定及表达分析。【方法】通过草莓全基因组数据分析FaMC蛋白的理化性质、结构域、系统发育关系和保守基序，采用qRT-PCR技术对草莓6个组织器官和6个果实发育时期中的FaMC基凶进行表达分析。【结果】蛋白序列分析表明，草莓基因组中21个FaMC成员分为3种类型：I型、I*型和n型。系统发育树和保守结构域分析表明：I型FaMC含N端前结构域且包含1个锌指结构;I*型FaMC含N端前结构域，但其中没有锌指结构;II型FaMC不含N端前结构域。基因表达分析发现，FaMC基因在不同组织中存在表达差异性，I型、I*型和II型FaMC基因分别在叶片、根和花中高表达。在果实发育过程中，多数I*型FaMC基凶的表达水平呈现出高-低-高的动态变化趋势;部分I型、II型FaMC在果实发育过程中呈现相反的表达模式。【结论】FaMC基因可能在草莓生长过程中发挥重要作用。
关键词：草莓;metacaspase;细胞程序性死亡（PCD）;基因组;表达分析
中图分类号：S668.4
文献标志码：A
文章编号：1008-0384（2020）11-1188-10
0引言
【研究意义】草莓（Fragaria×ananassa Duch.）为蔷薇科草莓属多年生草本植物，属于八倍体（2n=8x=56）凤梨草莓，是一种具有良好食用价值和重要经济价值的浆果类水果[1-2]。草莓果实为聚合果（假果），由花托膨大形成，瘦果（种子）分布在其表面[3]。在草莓的营养生长和生殖生长中，维管组织发挥重要作用：韧皮部筛管白上而下运输叶片光合作用的有机养料，木质部导管白下而上疏导根部吸收的水分和矿物质[4-5]。在果实发育过程中，维管组织连接瘦果和花托内部，为瘦果和周围的薄壁细胞提供营养[6]。而筛管和导管的形成过程具有典型的植物发育调控的程序性细胞死亡（programmedcell death，PCD）特征[7-8]。PCD是一种受基因调控的高度有序的细胞主动死亡过程，可以分为环境诱导PCD和植物发育调控PCD两大类[9-10]。其中，植物发育调控的PCD则发生在植物的大部分器官和组织中，比如果实、根、茎、叶和维管组织[9，11-12]。精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸酶（metacaspases，MCs）是一类多功能蛋白，参与植物的PCD调节、细胞周期和衰老等生长发育过程[13-15]。根据序列相似性和保守域特征，可以把植物中的MC分为3个类型：Type-I、Type-I*和Type-II[16]。MC蛋白包含一个类半胱天冬酶保守结构域（caspase-like domain， pfam00656），由p20和pl0亚基组成[13]。I型MC蛋白在p20亚基上游有一个保守的N端前结构域，而II型MC不含N端前结构域，但在p20和p10亚基之间的linker比I型MC长[16-17]。另外，在部分I型MC蛋白的N端前结构域中含有两个保守的C料C锌指结构（LSDI-Type zinc finger moitf）[18]，而把未含锌指结构的归类为Type-I*[16]。【前人研究进展】近年来，越来越多植物的基因組数据得到解析，MC基因家族已经在拟南芥[19]、水稻[20]、葡萄[21]、玉米[22]、梨[23]和森林草莓[23]等多种植物中得到鉴定与分析。例如，在森林草莓中鉴定出8个MC基因（FvMC01～FvMC08），分别为I型（FvMC01、FvMC04）、I*型（ FvMC05、FvMC07）和Il型（FvMC01、FvMC03、FvMC06和FvMC08）。在拟南芥中鉴出9个MC基因（AtMC1～AtMC9），该研究表明拟南芥AtMC基因在导管细胞分化和衰老过程中表现为典型的植物PCD差异表达。Bollhoner等的研究发现AtMC9调控拟南芥木质部导管细胞死亡中的细胞白溶[24]。AtMCl仅在叶脉中高表达[19]。在紫外线和过氧化氢的胁迫下，AtMC8基因表达量上调，加快了原生质体的PCD进程[25]。水稻OsMC基因在成熟组织中特异表达，可能参与调控叶片的衰老[20]。在葡萄胚珠发育过程中，有籽葡萄和无籽葡萄的VvMC基因表现出不同的表达模式。II型VvMC基因可能在葡萄成花和胚珠发育中起重要作用[21]。挪威云杉II型MC参与调节原胚团分化为体胚后期中的PCD[26]。此外，玉米MCs介导的蛋白水解是叶片衰老相关反应的一个关键步骤[22]。这些结果表明，MCs在不同植物生长发育中的PCD起重要作用。【本研究切入点】基于八倍体草莓高质量基因组数据的发布[]开展研究，为草莓FaMC基因家族的系统鉴定创造了条件。【拟解决的关键问题】本研究通过对草莓FaMC基因家族全基因组的鉴定，分析了该基因家族的理化性质、序列特征、系统发育关系、保守基序和亚细胞定位预测等信息，探究了该基因家族在不同组织部位以及不同果实发育时期中的表达模式，为进一步研究草莓MC家族基因功能奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
2018年2～3月，于福建省农业科学院生物技术研究所草莓品种保存示范基地，选取生长健壮、无病虫害的草莓红颜（Fragaria×ananassa Duch.‘Benihope）植株作为试材，包括根、茎、叶、花（完全开放后2d）、匍匐茎、幼果以及不同发育时期的果实。本研究把草莓果实分为6个发育时期：即小绿期（花后8d）、大绿期（花后15d）、白果期（花后23d）、始红期（花后26d）、片红期（花后29d）、全红期（花后32d），取白果期的果实作为幼果。每种材料取3次重复。样品用液氮速冻，-80℃储藏，用于后续RNA提取。
1.2试验方法
1.2.1草莓FaMC基因家族序列数据的获得 在NCBI数据库中搜索MC蛋白序列，并下载拟南芥AtMC基因家族所有的蛋白序列、CDS序列及全基因序列。在草莓基因组数据库（https：//www.rosaceae.org/species/fhgaria/a11）中，下载Fmgaria×ananassa CamarosaGenome Assembly vl.0.a1版本的草莓基因组数据。通过本地B1astp（E<0.001），搜索草莓基因组中所有MC蛋白，筛选出候选蛋白序列。利用NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）对候选基因的结构域进行CDD分析，剔除不符合条件的序列，确保每个草莓FaMC基因成员均含有典型caspase-like domain（Peptidase-C14）。
1.2.2草莓FaMC蛋白理化性质分析和亚细胞定位预测
通过ExPASy数据库（https：//web.expasy.org/protparam/）中的ProtParam对21条草莓FaMC蛋白质序列的氨基酸大小、相对分子量、理论等电点、不稳定指数、脂肪指数、亲水性等基本信息进行分析，以便分析该家族蛋白质的共性。利用PSORTPrediction（https：//psort.hgc.jp/form.html）对草莓FaMC蛋白序列进行在线亚细胞定位预测。
1.2.3草莓FaMC多重序列比对和系统进化分析 通过DNAMAN 6.0软件完成对草莓FaMC氨基酸序列的多重比对。利用MAGE 7.0软件对9条拟南芥AtMC氨基酸序列和21条草莓FaMC氨基酸序列进行多重比对，通过邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树。Bootstrap method设置为1000、Partial deletion处理缺失数据、P-distance模型，对拟南芥和草莓的MC进行分类。
1.2.4草莓FaMC蛋白结构域分析 利用NCBI数据库Conserved Domain（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）在线分析草莓FaMC蛋白保守结构域。通过Multiple Em for Motif Elicitation（MEME） suite 4.12.0（http：//meme-suite.org/index.html/）在线分析草莓FaMC蛋白保守基序，基序的数量设置为20个。通过TBtools软件绘制保守结构域（CDD）和保守基序（motif）的可视化图形。
1.2.5草莓FaMC基因家族的表达分析 对红颜草莓的6个不同组织部位和6个不同发育时期果实进行总RNA提取，采用天根RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（北京）并按操作说明书进行。使用TaKaRa的Prime Script RT reagent Kit with gDNAEeaser（上海）试剂盒合成cDNA用于实时荧光定量PCR。利用生工生物工程（上海）股份有限公司在线软件设计引物（表1），并由该公司合成。选用FaActin（登录号AB116565.1）作为内参基因。实时荧光定量PCR仪器为Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCRDetection System（上海），反应体系使用TaKaRa的SYBR Primer Ex TaqTM II试剂盒的方法，反应程序为94℃30s;94℃5s;60℃30s，40个循环，3次生物学重复。利用Excel对实时荧光定量PCR数据通过2-△△Ct法计算基因的相对表达量，利用HemI1.0软件绘制热图。
2结果与分析
2.1草莓FaMC基因家族序列數据的获得
将拟南芥9条AtMC蛋白序列与草莓蛋白数据库进行本地blastp搜索，对候选蛋白进行保守结构域分析，最终确定草莓中有21个FaMC蛋白，并从下载的草莓基因组数据中提取相应的FaMC基因序列，将其命名为FaMC1～FaMC21。
2.2草莓FaMC蛋白理化性质分析及亚细胞定位预测
通过在线工具ProtParam对草莓FaMC家族蛋白的理化性质进行预测分析（表2），结果显示该家族蛋白的氨基酸数量差异较大，FaMC10含有的氨基酸数最少，为290个，FaMC7、FaMC9、FaMC15、FaMC17含有的氨基酸数量最多，均为413个;该家族的蛋白质相对分子量在31000～47000，其中FaMC10的相对分子质量最小，为31963.38，最大的是FaMC15，为46277.63;其等电点在5.06～9.10，其中FaMC2的等电点最低，为5.06，最高的是FaMC14，为9.10;不稳定系数在36～63，亲水性系数皆为负值，这说明该家族蛋白质均为稳定的疏水性蛋白。
亚细胞定位预测发现，草莓FaMC蛋白主要集中在叶绿体、细胞质、线粒体和细胞核（表2）。以叶绿体中分布最为广泛，多达12个成员;其次为细胞质和线粒体;另外，只有FaMC5定位于细胞核。预测的草莓FaMC蛋白的亚细胞定位在不同的细胞器中，推测可能与不同成员所执行的功能相关。
2.3草莓FaMC多重序列比对和系统进化分析
根据草莓FaMC蛋白的氨基酸序列多重比对结果，21个草莓FaMC蛋白均包含一个保守的caspase-like domain，进一步证明这21条蛋白均属于MC家族。如图1所示，caspase-like domain由p20亚基、p10亚基和一段linker连接区域组成。FaMC3～FaMC6、FaMC10～FaMC16、FaMC19～FaMC21均在p20亚基上游含有一个富含脯氨酸（Pro）和谷氨酰胺（Gln）的N端前结构域，属于I型FaMC，其中FaMC4～FaMC5、FaMC12～FaMC14、FaMC20～FaMC21含有一个保守的锌指结构（LSDI-Type zinc finger）。前人把I型MC蛋白中不含锌指结构的归类为一个亚型Type I*，即FaMC3、FaMC6、FaMC10～FaMC11、FaMC15～FaMC16和FaMC19。FaMC1～FaMC2、FaMC7～FaMC9、FaMC17～FaMC18没有N端前结构域，但是在p10和p20两个亚基之间有一个长连接区（linker），属于TypeII型。综上所述，21个草莓FaMC成员分为三个类型，即Type1、Typel*和TypeII。
为了进一步探究草莓FaMC家族成员的进化关系，通过MEGA 7.0软件对拟南芥和草莓MC蛋白采用邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树。结果如图2所示，其中I型FaMC有17个（含I*型FaMC），包括拟南芥的AtMCI～AtMC3和草莓的FaMC3～FaMC6、FaMC10～FaMC16、FaMC19～FaMC21。II型MC共有13个，包括拟南芥AtMC4～AtMC9和草莓FaMC1～FaMC2、FaMC7～FaMC9、FaMC17～FaMC18。系统发育树把I*型聚类到I型FaMC中，草莓与拟南芥MC蛋白具有较高的同源性，推测草莓与拟南芥的直系同源蛋白之间具有相似的功能。
2.4草莓FaMC蛋白结构域分析
为了进一步研究草莓FaMC蛋白的不同功能，根据保守结构域和motif的分析结果构建MC蛋白结构示意图（图3）及氨基酸保守序列表（表3）。如图3-A、B所示，所有草莓MC蛋白具有高度保守的Peptidase-C14结构域，也就是上文所述的caspase-like domain。I型MC中只有FaMC14的Peptidase-C14的长度不足200aa，其他FaMC长度差异不大，均为250--280aa，分布的位置有明显差异。I*型中Peptidase-C14的长度与I型相似。II型FaMC中的Peptidase-C14分布位置大致相同，长度却有明显差异，FaMCI、FaMC8、FaMC18均为300aa，而FaMC2、FaMC7、FaMC17为155～170aa。
如图3-C、表3所示，在草莓FaMC蛋白中共鉴定出20个个模序（motif），分别命名为motifl～motif20，长度在11～50个氨基酸。利用Pfam和SMART数据库对这20个motif进行注释，我们发现motifl～4、motif6和motif10参与编码caspase-like domain：
在I型、I*型FaMC蛋白中的是motif1～3、motif6;而II型FaMCs蛋白中保守的是motif1～2、motif10。值得注意的是，在同类型FaMC蛋白中，亲缘关系最相近成员的motif组成和分布也高度相似，比如I型中的FaMC4、FaMC12～FaMC13、FaMC20～FaMC21以及II型中的FaMCI、FaMC8、FaMC18，推测这些蛋白的功能可能也是相似的。同时，这两种类型FaMC的motif组成和分布也存在一定的差异。I型FaMC特有的是motif3、motif6、motif13和motif15，而motif8、motif10～11只分布在II型FaMC中。
2.5草莓FaMC基因在不同组织的表达分析
为了进一步研究草莓FaMC基因家族成员的组织表达特性，通过qRT-PCR测定了红颜草莓不同组织部位中该家族基因的相对表达量，并以叶片为对照，将其相对表达量标准化为1，分别计算出其他组织的相对表达量（图4-A）。结果显示，21个FaMC基因在检测的各组织中均有表达，且在不同组织中的相对表达量存在明显差异。叶片中相对表达量较高的为FaMC4、FaMC5、FaMC11、FaMC12和FaMC20，FaMC6、FaMC10、FaMC14和FaMC16在根部表达量较高，茎中相对表达量较高的是FaMC6、FaMC10和FaMC14。以上均为I型和I*型FaMC基因，表明I、I*型FaMC基因主要在草莓富含维管组织的叶片、根和茎中发挥作用，与草莓的营养生长相关。而II型FaMC基因（FaMC1～FaMC2、FaMC7～FaMC9、FaMC17～FaMC18）在花和幼果中普遍有较高的表达水平，而在根、茎和匍匐茎中低表达，推测其可能与草莓生殖生长或果实发育相关。
2.6草莓FaMC基因在果实不同发育时期的表达分析
为了深入了解FaMC基因在红颜草莓果实发育过程中的表达模式，对6个果实发育阶段的FaMC基因表达谱进行了分析。以小绿期（S1）为对照，将其相对表达量标准化为1，分别计算出其他发育时期的相对表达量（图4-B）。结果显示，FaMC不同成员在6个果实发育时期的表达模式各异。多数I型FaMC基因（FaMC4、FaMC12、FaMC13、FaMC20和FaMC21）在果实的整个发育成熟过程中的相对表达量较高。其中，FaMC12在始红期（S4）和全红期（S6）表达水平上调。I*型FaMC基因（FaMC3、FaMC6、FaMC10、FaMC11、FaMC15和FaMC16）的表达水平在大绿期（S2）均略微上调，白果期（S3）后逐步下调。4个II型FaMC成员（FaMC2、FaMC7、FaMC9和FaMC17）在6个发育时期中的表达水平没有发生明显变化，而其他3个II型成员（FaMC1、FaMC8和FaMC18）在小绿期（S1）高表达，从大绿期（S2）开始到白果期（S3）、始红期（S4）、片红期（S5）以及全红期（S6）持续下调，表明这些FaMC基因可能在果实特定的发育阶段起重要作用。
3讨论与结论
植物MC基因是多基因家族，不同物种中MC家族成员的数量有很大差异，比如黄瓜5个CsMC基因[27]、水稻8个OsMC基因[20]、森林草莓8个FvMC基因[23]、拟南芥9个AtMC基因[19]、大麦10个HvMC基因[28]。本研究通过对八倍体草莓基因组数据的分析，鉴：定出了21个草莓FaMC成员（FaMCl～FaMC211），表明草莓的FaMC基因家族成员数量确与其他物种存在差异。Fagundes等发现I型MC基因的总数是II型MC基因数量的两倍[14]，与本研究结果一致草莓I型FaMC基因（14个，包含7个I*亚型）的成员数刚好是II型FaMC基因（7个）的两倍。而二倍体森林草莓中I型和I*型FvMC基因均为2個，II型成员数为4个。通过蛋白序列多重比对分析、亚细胞定位预测和motif组成分析等表明，21个草莓FaMC与拟南芥、水稻、大麦、黄瓜和葡萄等分析结果基本一致[19-21，27-28]。而对草莓和拟南芥MC蛋白的系统发育分析结果显示，I*型MCs没有被很好聚类，推测可能是由于拟南芥中缺乏I*型AtMC导致。
PCD是植物生命周期的重要組成部分。MC基因家族广泛参与植物生长发育和环境应激调控的PCD[13-14]。前人研究表明，植物MC基因的表达存在组织差异性。拟南芥I型AtMCl仅在叶脉中高表达[19]。葡萄I型VvMC在茎中均有较高的表达水平[21]。拟南芥AtMC9在木质部和侧根冠PCD过程中表达量上调，调控木质部导管PCD中的细胞自溶[24]。杨树PttMC13和PttMC14是拟南芥AtMC9的同源基因，同样参与调控木质部导管细胞的PCD和蛋白水解[29]。本研究中多数I型FaMC基因在叶片中高表达，I*型中只有FaMC6和FaMC10在根部表达量较高，说明这些基因可能在草莓的营养生长中发挥重要作用。在拟南芥的花粉、胚胎维管束中观察到AtMC2启动子的GUS表达增强[19]，五个梨PbMCs基因在花粉粒成熟和花粉管伸长过程中均有转录活性[23]，说明这些MC可能在生殖发育过程中起重要作用。本研究中II型FaMC基因（faMC1～FaMC2、FaMC7～FaMC9、FaMC17～FaMC18）主要在花和幼果中高表达，而在根、茎和匍匐茎中低表达，推测其可能与草莓生殖生长相关。
器官的成熟与衰老被认为是植物发生PCD过程的典型例子，比如果实的成熟，是一种动态的、受严格调控的发育过程，包括基因的表达[5]。在小麦颖果的维管组织韧皮部筛分子（SEs）发育过程中，TaeMCA II的表达水平呈现先升高后降低，随后又升高的动态变化趋势，暗示该蛋白可能在SEs的发育后期同样发挥作用[30]。有趣的是多数I*型FaMCs（如FaMC3、FaMC6和FaMC16基因）在草莓果实发育过程中的相对表达量也呈现出相似的动态变化趋势，是否这些I*型FaMC基因也与参与调控草莓果实的发育成熟有待于进一步验证。本研究中随着果实的发育，个别I型和II型FaMC基因有着截然相反的表达模式，例如I型FaMC12、FaMC13在果实发育初期低表达，成熟期高表达，而II型FaMC18表达在果实发育初期的相对表达量最高，成熟期为低表达。推测I、II型FaMC基因可能在草莓果实发育过程中发挥不同的作用。Aharoni等人指出，在草莓果实发育成熟过程中，与维管发育相关基因的表达是活跃的[5]。草莓FaMC基因家族是否与果实发育成熟中维管组织存在某种相关性还有待进一步研究。
综上所述，本研究在草莓全基因组范围内开展对FaMC基因家族的鉴定与分析，基于系统发育聚类和序列特征把21个基因成员分为三个类型。对全家族成员进行蛋白结构域、理化性质和保守基序分析，得到荧光定量表达数据，为揭示FaMC基因家族在草莓营养生长和生殖生长过程中的作用提供一定的理论基础。
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（责任编辑：张梅）
郑益平，陈坚，朱炳耀.草莓Metacaspase基因家族全基因组鉴定及表达分析[J].福建农业学报，2020，35（11）：1188-1197.
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收稿日期：2020-08-16初稿：2020-10-08修改稿
作者简介：郑益平（1988-），女，硕上，研究实习员，研究方向：花卉遗传育种（E-mail：
360213443@qq.com）
*通信作者：朱炳耀（1962-），男，副研究员，研究方向：植物资源收集与利用（E-mail：
25lll2023@qq.com）
基金项目：福建省科技计划公益类专项（2018Rl019-10）
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