初雅洁
摘 要：本文对辣木多糖除蛋白的工艺进行了研究，以辣木蛋白脱除率和多糖保留率为指标，比较三氯乙酸法、Sevage法、木瓜蛋白酶法的除蛋白效果，并采用单因素实验优化木瓜蛋白酶法除蛋白的工艺。结果表明：木瓜蛋白酶法除蛋白工艺较简单，且除蛋白的最佳工艺为酶解时间1.5 h、温度60 ℃、pH=6.0时蛋白脱除率和多糖保留率均较高。
关键词：辣木;多糖;除蛋白;工艺研究
Abstract：In this paper， the process of removing the protein of Spicywood Polysaccharide was studied， and the removal rate of Spicywood Polysaccharide and the protection of polysaccharide were studied. Compared with trichloroacetic acid， Sevage and papain， the single factor experiment was used to optimize the process of papain. The results showed that the protein was removed by papain enzyme. The process is simple， and the best process for protein removal is enzymatic hydrolysis time 1.5 h、temperature 60 ℃， pH=6.0， protein removal rate and polysaccharide retention rate are higher.
Key words：Spicewood; Polysaccharide; Deprotein; Process research
中圖分类号：R284.2
辣木（Moringa oleifera Lam.）起源于印度，属于热带、亚热带多功能植物类别，并以常绿或者半落叶形态存在。因辣木叶片与果荚含各种矿物质以及维生素等使辣木已经成为人们重点关注与研究的植物类型。结合相关调查数据显示，辣木在人体必需氨基酸的含量表现方面，明显要比世界卫生组织推荐摄入标准高[1]。据资料显示，辣木中的钙元素含量及蛋白质含量远比牛奶中的物质含量高得多，可高达4倍和2倍左右。其中，钾元素含量比香蕉中的含量高出3倍左右、维生素A含量比胡萝卜高出4倍左右。结合当前发展情况来看，辣木凭借自身丰富的营养价值已经被广泛应用于医疗保健与饮食卫生领域当中，发展前景较为宽阔。
多糖物质一般广泛存在于动植物以及微生物细胞壁中，是生物体重要生物分子之一。近些年来，随着植物多糖的生物活性逐渐被人们认知，它凭借自身独特活性以及低毒效应在医疗临床应用中发挥了较大价值。但是多糖本身结构较为复杂且质量标准不易被控制，再加上部分多糖在天然产物中含量较低、不易被分离，导致多糖研究与临床应用频频受阻。但从客观角度上来看，我国多糖资源较为丰富，尤其是中草药植物中的多糖成分较多，在开发潜力方面表现较为明显。而辣木作为一种功能性植物，内部含有丰富的多糖物质，可以被应用于医疗保健与饮食卫生领域中，结合当前研究情况来看，关于辣木多糖的研究工作主要集中在提取工艺以及含量测定方面。对于辣木多糖分离纯化工艺的研究内容相对较少。因此，本文研究工作主要以确定最佳的辣木多糖脱蛋白工艺为主，以期为辣木粗多糖分离纯化提供一定的技术支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
无水乙醇、辣木粗糖、蒸馏水、氯仿、正丁醇、木瓜蛋白酶、考马斯亮蓝、浓硫酸、苯酚等。
1.2 仪器与设备
分光光度计、便携式酸度计、离心机、摇床机、数显恒温水浴锅、pH计、海尔冰箱等。
1.3 研究方法
1.3.1 辣木多糖的提取
辣木粉→石油醚脱脂→80%乙醇回流提取两次→热水浸提→抽滤→减压浓缩→无水乙醇沉淀→静置过夜→无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→减压干燥→辣木粗多糖[2-4]。
1.3.2 Sevage法除蛋白
取多糖样液配成5%的水溶液，加入1/3体积的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1）充分振摇10 min，离心分离15 min（4 000r·min-1），取上清液，重复上述步骤，测定蛋白和多糖吸光度[5]。
1.3.3 三氯乙酸法[6]
取多糖样液50 mL，加入50 mL的3%三氯乙酸，使溶液均匀混合。于5～10 ℃冰箱中放置过夜，离心去除沉淀，测定蛋白和多糖的吸光度。
1.3.4 木瓜蛋白酶法
取10 mL多糖提取液，加入0.2 mL木瓜蛋白酶液（15 g·L-1），55 ℃酶解1.5 h，反应结束后沸水浴10 min，然后冷却至室温，4 000 r·min-1离心10 min后去除沉淀，测定蛋白和多糖吸光度[7]。
1.3.5 木瓜蛋白酶法除蛋白单因素试验
（1）酶解时间对蛋白去除率的影响。分别取10 mL多糖提取液，并向提取液中加入0.2 mL木瓜蛋白酶液。其中，控制溶液中pH=6、酶解温度为55 ℃。关于酶解时间的确定，可以分为设置为0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h。反应结束之后，需要将溶液沸水浴处理10 min。冷却至室温之后，以4 000 r·min-1的速度进行离心处理，处理结束后去除沉淀。并在此基础上，对上清液蛋白浓度进行科学测定。
（2）酶解温度对蛋白去除率的影响。分别提取10 mL多糖提取液，并向提取液中加入0.2 mL木瓜蛋白酶液。其中，控制溶液中pH=6。关于酶解温度的控制，分别设置为50、55、60、65 ℃和70 ℃。反应结束之后，需要将其置于沸水浴当中，处理10 min后。将其冷却至室温。并在此基础上，以4 000 r·min-1的离心速度去除沉淀。并对上清液蛋白浓度进行合理测量与分析。
（3）酶解pH对蛋白去除率的影响。分别提取10 mL多糖提取液，并向提取液中加入0.2 mL木瓜蛋白酶液。其中，将溶液pH值控制到3、4、5、6和7当中。将溶液置于55 ℃水浴酶解，酶解处理1.5 h之后，沸水浴10 min。冷却至室温之后，以4 000 r·min-1离心速度，处理10 min后去除沉淀。并在此基础上，对上清液蛋白浓度进行合理测定。
2 结果与分析
2.1 Sevage法除蛋白
Sevage法是利用有機溶剂使溶液中的蛋白质变性而分离清除蛋白质，结果见图1。由图可知，脱蛋白4次后蛋白清除率基本稳定，多糖仍有少量下降，因此，最佳脱蛋白次数为4次。
2.2 三氯乙酸法除蛋白
三氯乙酸是酸性物质，能使蛋白质带正电荷，并与负离子结合成不溶性的盐类，结果见图2。由图可知，蛋白清除率随着三氯乙酸脱蛋白次数的增加不断升高，脱蛋白次数达到第4次时基本稳定，而多糖保留率仍在下降，因此，最佳脱蛋白次数为4次。
2.3 酶法除蛋白单因素实验
2.3.1 酶解时间对蛋白清除率的影响
由图3可知，随着酶解时间的延长蛋白清除率逐渐增大，但1.5 h之后蛋白清除率随时间延长变化不明显，多糖保留率随酶解时间延长而降低，说明反应的最适时间为1.5 h左右。
2.3.2 酶解温度对蛋白清除率的影响
由图4可知，随着酶解温度的升高，蛋白清除率逐渐增大，温度达到60 ℃趋于稳定。而多糖保留率随酶解温度升高逐渐降低，说明该酶的最适反应温度在60 ℃左右。
2.3.3 pH值对蛋白清除率的影响
随着多糖溶液的pH值不同，酶对蛋白的清除率也会相应的发生变化，由图5可知，pH=6时蛋白的清除率最大，随后趋于稳定，多糖保留率却逐渐下降，说明该酶的最适反应pH值为6。
综上所述，酶法脱蛋白的最适pH为6、最适温度为60 ℃、最适反应时间为1.5 h。
3 结论
研究发现，三氯乙酸法和Sevage法除蛋白工艺复杂，需要多次重复进行。综合比较上述试验结果，木瓜蛋白酶法更适用，且最佳工艺为酶解时间1.5 h、温度60 ℃、pH=6.0，结合各项指标得出木瓜蛋白酶脱蛋白方法效果最好，为辣木多糖脱蛋白进一步研究提供了参考。
参考文献：
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[2]陈志慧.正交试验法优选猕猴桃果水溶性多糖的提取工艺[J].河南工业大学学报（自然科学报），2005（3）：87-90.
[3]张国华，李绍平，季晖，等.正交设计优化冬虫夏草多糖的提取工艺[J].安徽医药，2004（6）：404-405.
[4]张涛，马海乐，钟慧慧.分光光度法测定辣木多糖含量[J].粮油食品科技，2004（1）：32-33.
[5]张萍，贺茂萍，殷力，等.石榴皮多糖的Sevage法除蛋白工艺研究[J].食品科技，2013（12）2019-222.
[6]徐韧博，邹攀，杨鑫.红松松塔多糖三氯乙酸法脱蛋白工艺研究[J].中国甜菜糖业，2013（1）：5-8.
[7]杨辉，闫明明.响应面法优化酸性蛋白酶脱除大枣多糖蛋白工艺[J].糖食与油脂.2012，25（11）：49-52.
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