高洁 史明鹏 宋婷婷 宋姗爱 王慧云 刘自民
[摘要]目的验证二代测序（NGS）与免疫组织化学（IHC）技术在胃癌人表皮生长因子受体2（HER2）状态评估中的一致性，分析HER2阳性胃癌微卫星不稳定性（MSI）、程序性死亡配体1（PD-L1）表达与临床病理特征的关系。方法收集行胃癌手术且术后组织標本IHC检测HER2（3+）病人92例。采用NGS技术检测病人癌组织中HER2基因扩增情况及MSI状态;采用PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒检测癌组织中PD-L1的表达情况，结果分别以阳性组合评分（CPS）和肿瘤比例评分（TPS）进行计算。结果IHC检测HER2阳性的胃癌病人92例，NGS检测84例存在HER2基因扩增，IHC与NGS检测结果的一致率为91.3%。92例HER2阳性胃癌病人中，微卫星稳定（MSS）病人90例（97.8%），微卫星高度不稳定（MSI-H）病人2例（2.2%）;84例存在HER2基因扩增的病人均呈MSS状态，无MSI-H病人。按CPS标准，92例HER2阳性病人PD-L1阳性率为89%，PD-L1表达与临床病理特征之间无相关性。按TPS标准，92例HER2阳性病人PD-L1阳性率为24%，PD-L1表达与临床病理特征之间无相关性。结论IHC和NGS技术检测胃癌组织HER2表达的一致率较高。胃癌组织中HER2基因扩增与MSI-H可能存在互斥关系。HER2阳性胃癌CPS标准下的PD-L1阳性率高于TPS标准下的PD-L1阳性率，但二者均与临床病理特征无关。
[关键词]胃肿瘤;人表皮生长因子受体2;B7-H1抗原;微卫星不稳定性;高通量核苷酸序列分析;免疫组织化学
[中图分类号]R735.2[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2021）01-0059-05
[ABSTRACT]ObjectiveTo verify the consistency of next-generation sequencing （NGS） and immunohistochemistry （IHC） in assessing the status of human epidermal growth factor receptor 2 （HER2） in gastric cancer， and to investigate the association of microsatellite instability （MSI） and programmed death ligand 1 （PD-L1） expression with clinicopathological characteristics of HER2-positive gastric cancer. MethodsA total of 92 patients who underwent gastric cancer surgery and whose postoperative tissue specimen was HER2（3+） based on IHC were enrolled. NGS technique was used to detect HER2 gene amplification and MSI status in cancer tissue; PD-L1 IHC 22C3 pharmDx kit was used to measure the expression of PD-L1 in cancer tissue; the results were calculated by combined positive score （CPS） and tumor proportion score （TPS）. ResultsIn this study， there were 92 gastric cancer patients with positive HER2. NGS detection showed that 84 patients had HER2 gene amplification， and the consistency rate between IHC and NGS detection was 91.3%. Among the 92 patients with HER2-positive gastric cancer， 90 （97.8%） had microsatellite stable （MSS） tumors and 2 （2.2%） had microsatellite instability-high （MSI-H） tumors; and 84 patients with HER2 gene amplification had MSS tumors， while no patient had MSI-H tumors. According to the CPS criteria， 92 HER2-positive patients had a positive rate of PD-L1 of 89%， and there was no association between PD-L1 expression and clinicopathological characteristics. According to the TPS criteria， 92 HER2-positive patients had a positive rate of PD-L1 of 24%， and there was no association between PD-L1 expression and clinicopathological characteristics. ConclusionIHC and NGS have a high consistency rate in detecting the expression of HER2 in gastric tissue. There may be a mutually exclusive relationship between HER2 gene amplification and MSI-H in gastric cancer tissue. The positive rate of PD-L1 in HER2-positive gastric cancer under the CPS criteria is higher than that under the TPS criteria， but they are not associated with clinicopathological characteristics.
[KEY WORDS]stomach neoplasms; human epidermal growth factor receptor 2; B7-H1 antigen; microsatellite instability; high-throughput nucleotide sequencing; immunohistochemistry
人表皮生長因子受体2（HER2）阳性的转移性/不可切除胃癌病人预后差，曲妥珠单抗联合化疗是目前标准治疗模式，但该联合方案的生存获益有限。免疫治疗被认为是肿瘤治疗中最具前景的治疗方法，然而其在胃癌中的应用仍不理想，且缺乏筛选有效人群的理想生物标记物。微卫星不稳定性（MSI）及程序性死亡配体1（PD-L1）的表达水平在多种肿瘤中显示出与免疫治疗效果密切相关，但目前关于胃癌病人HER2状态、MSI状态及PD-L1表达情况相关性研究报道较少。本研究旨在验证二代测序（NGS）与免疫组织化学（IHC）技术在胃癌HER2状态评估中的一致性，分析HER2阳性胃癌组织中MSI状态、PD-L1表达与临床病理特征的关系。
1资料与方法
1.1一般资料
使用关键词“胃癌”、“大标本”、“HER2”在青岛大学附属医院病理资料数据库中搜索2013年1月—2017年12月行胃癌手术的病人，共搜索到病人1 390例。所有病人术后大标本均已进行HER2的IHC检测，其中105例病人的组织标本为HER2（3+），即HER2阳性，选取92例术前未行放化疗的HER2阳性胃癌病人纳入本研究。入组的92例病人中，男性75例，女性17例;年龄35～87岁，中位年龄64岁;AJCC第8版分期Ⅰ期11例，Ⅱ期32例，Ⅲ期41例，Ⅳ期8例;Lauren分型肠型58例，弥漫型12例，混合型21例;腺癌82例，黏液腺癌5例，印戒细胞癌5例;高分化2例，中分化39例，低分化51例。
1.2NGS检测HER2基因有无扩增及MSI状态
1.2.1组织DNA提取石蜡组织切片行脱蜡、刮片、消化、升温、离心等处理，收集洗脱液于无菌离心管中，进行NGS检测。
1.2.2文库构建先将基因组DNA进行超声片段化处理，然后进行末端修复、3′端加A、添加接头以及PCR扩增，得到预文库。预文库在探针作用下进行16～24 h的杂交，抓取出检测所需的目的片段，最后给靶序列加上测序所需的分子标签，完成文库构建。
1.2.3基因测序使用IlluminaNextseq 500/550测序仪以快速模式进行大规模平行测序。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机软件将光学信号转化为测序碱基。
1.2.4数据分析NGS检测会产生大量的原始序列数据，将原始序列数据进行初级处理，过滤后得到clean data（删除质量不好的原始数据后得到的数据，常见的删除方法有去接头、去N含量高及质量评分较低的原始数据等）。对clean data进行序列比对并捕捉基因点突变、缺失、插入、拷贝数变化、结构变异等多种变异信息，并注释。用SPSS 22.0软件进行结果分析。
1.3IHC检测PD-L1蛋白表达
应用22C3抗体浓缩物在Dako ASL48自动染色仪中对组织标本进行染色，将染色结果与Dako ASL48平台上的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒进行比对以评估PD-L1表达。IHC检测均设阳性对照和阴性对照。
1.4检测结果判定
1.4.1HER2基因扩增及MSI状态①HER2基因扩增：拷贝数/细胞2.75～3.00，且一个基因60%以上的探针捕获区域（bin）在癌症样本中的覆盖深度显著高于基线水平，同时整个基因区域的覆盖水平与基线水平差异具有统计学意义。②MSI状态：40%以上MSI基因座（loci）长度不稳定，则认为是微卫星高度不稳定（MSI-H）;小于15% MSI loci长度不稳定，则认为是微卫星稳定（MSS）;如果长度不稳定的MSI loci在15%～40%之间，则认为是微卫星低度不稳定（MSI-L）。
1.4.2PD-L1表达阳性①组合阳性评分（CPS）：PD-L1染色细胞（包括肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）的数量除以活肿瘤细胞总数再乘以100。如果CPS≥1，则认为该病人存在PD-L1过表达，即PD-L1表达阳性。②肿瘤比例评分（TPS）：相对于样品中存在的所有肿瘤细胞中PD-L1阳性细胞（具有（1+）～（3+）强度的全部或部分细胞膜染色的活肿瘤细胞）的百分比。如果TPS≥1%，则认为该病人存在PD-L1过表达，即PD-L1表达阳性。
1.5统计分析
用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1HER2基因扩增情况
本研究IHC检测HER2（3+）胃癌病人92例，NGS检测显示84例病人存在HER2基因扩增，8例病人未显示HER2基因扩增，IHC与NGS检测结果的一致性为91.3%。HER2基因扩增病人中合并HER2基因错义突变者10例（10.7%），合并基因融合者17例（20.7%），同时合并基因错义突变与基因融合者1例（1.1%）。
2.2MSI状态与HER2基因扩增的关系
本文研究92例HER2阳性胃癌病人中，MSS病人90例（97.8%），MSI-H病人2例（2.2%），84例发生HER2基因扩增的病人均呈MSS状态，无MSI-H病人，HER2基因扩增与MSI-H可能存在互斥关系。
2.3CPS标准下HER2阳性胃癌组织中PD-L1表达与临床病理特征的关系
本研究92例HER2阳性胃癌病人PD-L1阳性率为89%，其中CPS≥5者占81.5%，CPS≥10者占55.0%。在该评分标准下，PD-L1表达与病人的临床病理特征无相关性（P>0.05）。见表1。
2.4TPS标准下HER2阳性胃癌组织中PD-L1表达与临床病理特征的关系
本研究92例HER2阳性胃癌病人PD-L1阳性率为24%，无PD-L1表达超过50%的病人。在该评分标准下，PD-L1表达与病人的临床病理特征无相关性（P>0.05）。见表2。
3讨论
目前，HER2受体是胃癌靶向治疗最为有效靶点，其过表达主要由HER2基因扩增导致，临床常用检测方法为IHC和荧光原位杂交（FISH），阳性标准是HER2 IHC（3+）或IHC（2+）/FISH+。各国家/地区的HER2阳性胃癌发病率存在差异，为7%～34%，两项针对中国人群的研究结果分别为13%和12%[1-2]。本研究共检索到青岛大学附属医院2013年1月—2017年12月行胃癌手术且行HER2 IHC检测病人1 390例，其中HER2（3+）胃癌病人105例，HER2（2+）胃癌病人53例，阳性率为7.5%。此结果与我国既往报道的研究数据差异较大，考虑主要原因是IHC检测HER2（2+）者未采用FISH检测进一步验证和数据搜索时出现信息偏倚。ROSS等[3]研究表明，在乳癌和胃癌中采用NGS技术确定HER2状态是可行的，尤其是针对IHC或者FISH评价中模棱两可的病例具有明显优势。JANJIGIAN等[4]研究显示，对于评估胃癌组织HER2阳性状态，IHC/FISH和NGS的一致率为93.7%。在本研究中，IHC检测HER2（3+）病人共92例，NGS检测84例发生HER2基因扩增，两者一致率为91.3%，与上述研究结果基本一致，提示NGS检测可以作为胃癌HER2状态评估的方法之一。
有研究结果显示，MSI-H在胃癌中的发生频率为5.6%～33.3%，但是并无研究报道其在HER2阳性胃癌中的发生频率[5]。癌症基因组图谱（TCGA）数据显示，MSI-H的胃癌病人占21.7%，该亚型具有高突变率，但是缺乏HER2等常见基因的扩增结果[6]。亚洲癌症研究小组（ACRG）的研究结果显示，61例MSI胃癌病人均未见HER2基因扩增，在MSS胃癌病人中HER2基因擴增更常见。本研究中，92例HER2阳性胃癌病人中有MSI-H胃癌病人2例（2.2%），但是发生HER2基因扩增的84例胃癌病人均表现为MSS，未发现MSI-H病人，结合TCGA、ACRG研究结果，我们认为HER2基因扩增与MSI-H之间可能存在互斥关系。当然，这需要进一步分子研究证实。
对于应用于胃癌中计算PD-L1表达量的两种方法，TPS已被证实不能有效预测病人对免疫药物的治疗反应，而CPS则具有良好的预测作用及可重复性。这两者的区别在于CPS不只反映肿瘤细胞中PD-L1的表达，同时还反映了免疫细胞中PD-L1的表达。既往研究显示，胃癌组织中PD-L1过表达与浸润深度（T分期）、淋巴结转移（N分期）、血管侵犯、EB病毒感染、MSI状态等显著相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、Lauren分型、TNM分期、淋巴管侵犯、神经浸润等无明显关系[7]。而本研究结果显示，无论在TPS还是在CPS标准下，PD-L1过表达与HER2阳性胃癌病人的性别、年龄、肿瘤部位、术后分期、T分期、N分期、血管浸润、神经侵犯、分化程度等均无明显关系。本研究中CPS标准下HER2阳性胃癌病人PD-L1的阳性率为89%，明显高于以往报道的胃癌组织PD-L1阳性率。根据公式CPS=TPS+MIDS（免疫细胞PD-L1染色阳性的比例）[8]，可以大体估算HER2阳性胃癌组织中免疫细胞PD-L1阳性率约为65%，而THOMPSON等[9]报道胃癌组织中浸润免疫细胞的PD-L1阳性率为44%，可以看出HER2阳性胃癌组织免疫细胞上有更多的PD-L1表达。有研究表明，HER2受体过表达可促进胃癌细胞上PD-L1的表达;进一步研究发现，抑制HER2信号转导途径中PI3K-AKT-mTOR通路可降低发生HER2蛋白过表达的胃癌细胞上PD-L1的表达[10-11]。上述研究在不同方面解释了本研究中HER2阳性胃癌组织中PD-L1阳性率较高的原因。
KEYNOTE-061Ⅲ期临床试验的阴性结果宣告了免疫治疗在胃癌二线治疗中的失败，但亚组分析显示，在PD-L1 CPS≥10的病人中，帕博利珠单抗对比紫杉醇化疗观察到了总生存期（OS）获益的趋势（17.4 vs 10.8个月）[12]。本研究中，HER2阳性胃癌病人具有更高的PD-L1阳性率，其中CPS≥10的病人占55.0%，这提示HER2阳性胃癌病人更有可能在免疫治疗中获益。另外，临床前研究显示，抗程序性死亡受体1（PD-1）单抗联合抗HER2治疗存在协同作用，曲妥珠单抗可以刺激HER2特异性的T细胞反应，增加肿瘤细胞的PD-L1表达，而抗PD-1单抗可以增强曲妥珠单抗的T细胞特异性免疫[13-14]。2019年ASCO年会报道一项Ⅱ期临床研究结果显示，曲妥珠单抗联合化疗、帕博丽珠单抗治疗HER2阳性胃癌客观缓解率（ORR）达到87%，疾病控制率（DCR）高达100%，12个月的总生存率为76%，该研究证实了HER2阳性胃癌靶向治疗与免疫治疗联合治疗方案的应用价值[15]。
综上所述，IHC和NGS技术检测胃癌组织中HER2表达的一致率较高，NGS技术检测评估胃癌HER2状态具有潜在价值;胃癌组织中HER2基因扩增与MSI-H可能存在互斥关系;HER2阳性胃癌CPS标准下的PD-L1阳性率高于TPS标准下的PD-L1阳性率，但二者均与临床病理特征无关。本研究的不足之处是缺乏HER2阴性胃癌病例作为对照，故本研究结果仍需要进一步的研究证实。
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（本文編辑 马伟平）
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