毛莲英 李海碧 桂意云 张荣华 杨荣仲 周会 韦金菊 刘昔辉
摘要：【目的】探究甘蔗間作猫豆对甘蔗根际土壤微生物多样性的影响，为改善甘蔗根际土壤微生物群落结构及促进甘蔗生长提供理论参考。【方法】采用单因素试验设计，分析单作甘蔗（CK）和甘蔗间作猫豆（T处理）2种种植方式对甘蔗根际土壤养分的影响，并采用Illumina HiSeq高通量测序技术，在门和属水平上分析甘蔗根际土壤微生物群落结构，在种水平进行主成分（PCA）分析。【结果】T处理的根际土壤中全氮、全钾、水解性氮、有效磷和有机质含量均大于CK。T处理的根际土壤中细菌的丰富度和多样性高于真菌的丰富度和多样性;T处理的根际土壤中细菌丰富度高于CK，但差异不显著（P>0.05，下同），其多样性显著高于CK（P<0.05，下同）;T处理的根际土壤中真菌的丰富度和多样性均显著高于CK。CK和T处理土壤样品的主要优势细菌门为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria），其相对丰度均大于10.00%，优势细菌属分别为水恒杆菌属（Mizugakiibacter）、游动四孢属（Luedemannella）、乳杆菌属（Acidothermus）和布氏杆菌属（Bryobacte），但T处理根际土壤样品中水恒杆菌属、游动四孢属和乳杆菌属的相对丰度分别较CK下降2.47%、1.78%和0.68%，其他细菌属分别增加0.10%～0.86%。CK和T处理根际土壤中优势真菌门为子囊菌门（Ascomycota），分别为80.00%和92.00%，其次是担子菌门（Basidiomycota），分别为8.00%和6.00%，排名前3的优势真菌属均为戴氏霉属（Taifanglania）、毛壳属（Chaetomium）和镰刀菌属（Fusarium）。CK和T处理的6份根际土壤样品在种水平上的主成分（PCA）分析结果显示，细菌群落PC1的变异为29.37%，PC2的变异为20.26%，二者的总贡献率为49.63%;真菌群落PC1的变异为33.44%，PC2的变异为27.73%，二者的总贡献率为56.17%。CK与T处理的细菌群落分别属于不同象限，CK位于第1和第3象限，而T处理位于第2和第4象限。【结论】甘蔗间作猫豆可改善甘蔗根际的土壤养分状况，改变甘蔗根际微生物的群落结构，提高细菌和真菌的丰富度和多样性，但未影响优势菌门的排序。
关键词：
甘蔗;猫豆;间作;根际;土壤微生物;高通量测序;群落结构
中图分类号：
S556.106.1 文献标志码：
A 文章编号：2095-1191（2021）02-0332-09
Abstract：【Objective】The effects of Mucuna pruriens var. utilis intercropping with sugarcane on the microbial diversity in the rhizosphere of sugarcane were investigated，and a theoretical foundation was laid for improving the soil microbial community structure of M. pruriens intercropping with sugarcane and promoting the growth of sugarcane. 【Method】A single-factor design experiment was conducted to analyze the microbial community structure of sugarcane rhizosphere soil at the phylum and genus levels by Illumina HiSeq high-throughput sequencing technology under the two planting methods of sugarcane monoculture（CK） and sugarcane intercropping M. pruriens（T treatment），and principal component analysis （PCA） to determine the effect of intercropping M. pruriens on sugarcane rhizosphere soil nutrients. 【Result】The contents of total nitrogen，total potassium，hydrolyzable nitrogen，available phosphorus and organic matter in rhizosphere soil of T treatment were higher than those of CK treatment. The richness and diversity of bacteria in the rhizosphere soil of T treatment was higher than that of fungi. The bacterial richness of bacteria in the rhizosphere soil of Ttreatment was higher than that of CK，but the difference was not significant（P>0.05， the same below）， its diversity was significantly higher than that of CK（P<0.05， the same below）. The abundance and diversity of bacteria in the rhizosphere soil under T treatment were significantly higher than that of CK.The dominant phylum of bacteria in CK and T treatments were Proteobacteria，Actinobacteria，Chloroflexi and Acidobacteria，and their relative abundances were more than 10.00%. The dominant bacteria genera were Mizugakiibacter，Luedemannella，Actinothermus and Bruyobacte，but the relative abundances of Mizugakiibacter，Luedemannella，Actinothermus decreased by 2.47%， 1.78% and 0.68%， other bacteria increased by 0.10%-0.86% compared to CK under T treatment. The dominant fungal phyla in the rhizosphere soil of CK and T treatments was Ascomycota，80.00% and 92.00% respectively，followed by Basidiomycota，8.00% and 6.00%，the top three dominant fungi genus all belonged to the genus Taifanglania，Chaetomium and Fusarium. Principal component analysis（PCA） of six root soil samples treated with CK and T showed that the variation of bacterial community PC1 was 29.37%，the variation of PC2 was 20.26%，the total contribution rate of both was 49.63%; the variation of fungal community PC1 was 33.44%，the variation of PC2 was 27.73%，the total contribution rate of both was 56.17%. The bacterial communities of CK and T treatment belonged to different quadrants，respectively，CK was located in the 1st and 3rd quadrants，and T treatment was located in the 2nd and 4th quadrants. 【Conclusion】The results show that intercropping sugarcane with M. pruriens improves the soil nutrient status，changes the microbial community structure，and increases the richness and diversity of bacteria and fungi in sugarcane rhizosphere， but does not affect the sequence of dominant microflora.
Key words：
sugarcane; Mucuna pruriens var. utilis; intercropping; rhizosphere; soil microbe; high-throughput sequencing; community structure
Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31860350）; National Sugar Industry Technology System Project（CARS-170105）; Central Guides Local Project（Guike ZY20198005）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT006）
0 引言
【研究意义】甘蔗（Saccharum officinarum）为全球重要的糖类和能源作物，是种植行距较宽的作物，目前种植行距多为1.2 m，常与生长快速的作物间作或与生长期短的作物套种可有效改善土壤酶活性，提高土壤微生物数量和多样性，充分提升养分利用效率及经济效益（张爱加等，2013;彭东海等，2014;沈雪峰等，2014）。猫豆为一年生豆科黎豆属草质藤本植物，多分支，根系较发达，叶蔓攀高，覆盖面广，有利于保持水土，其根部富含根瘤菌，可有效提高土地肥力（秦祖臻等，2012;韦道鞍，2013;李经成等，2016），适合与其他作物间种。土壤微生物多样性不仅代表微生物群落的稳定性，同时还反映土壤的生态机制和土壤胁迫对微生物群落的影响，是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因（彭东海等，2014;张晟等，2019）。因此，探究甘蔗间作猫豆对甘蔗根际微生物多样性的影响，对改善甘蔗根际土壤菌群结构及促进甘蔗生长具有重要意义。【前人研究进展】据国内外研究报道，甘蔗间作模式多种多样，主要有甘蔗—蔬菜（如洋葱、马铃薯等）（Bokhtiar et al.，2003）、甘蔗—豆科植物（大豆）（Kamruzzaman and Hasanuzzama，2007）和甘蔗—禾本科植物（玉米）（郑亚强等，2018）等。研究发现，甘蔗间作大豆后能显著增加其根际土壤中的真菌和放线菌数量，土壤微生物群落多样性丰富，蔗田土壤得到有效改善（洪德星，2011;Li et al.，2013;彭东海等，2014），且甘蔗间作大豆后在甘蔗苗期和分蘗期蔗根的内生细菌多样性均大于单作处理（杨建波，2014）;甘蔗间作玉米后甘蔗根际微生物的群落多样性和土壤酶活性均高于单作甘蔗（郑亚强等，2016，2018）;甘蔗与大豆和花生间作能提高根际土壤微生物多样性和土壤酶活性（邢德峰和任南琪，2006;Vo?í?ková and Baldrian，2013）。上述研究主要利用传统培养方法或变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术探讨甘蔗与不同作物间作对其根际土壤微生物的影响，然而传统方法培养的微生物无法全面准确地反映根际土壤微生物的多样性特征（张洪霞等，2009），尤其是DGGE技术仅能分析有限的优势微生物类群，存在高估物种丰富度及低估微生物群落大小和多样性的可能，很难检测出低丰度的土壤微生物类群（Tan et al.，2015）。近年来，高通量测序已成为定量和鉴别微生物群落演替研究的重要工具，尤其是二代高通量测序技术具有测序通量高、试验过程简化、速度快和准确率高等优点，能更真实地揭示原位环境中微生物群落的复杂性和多样性（李庆岗和陶立，2012），已广泛用于生态系统土壤微生物多样性研究（Will et al.，2010;井赵斌等，2013）。张东艳等（2017）采用Illumina HiSeq高通量测序技术研究玄参与烟草间作后根际土壤细菌群落结构，结果发现，间作降低了烟草根际土壤细菌丰富度和多样性，但提高了玄参根际土壤细菌多样性。【本研究切入点】目前鲜见有关高通量测序技术对甘蔗间作猫豆后甘蔗根际土壤微生物多样性进行分析的文献报道。【拟解决的关键问题】利用Illumina HiSeq高通量测序技术分析甘蔗间作猫豆后甘蔗根际土壤微生物群落结构及多样性，为改善甘蔗根际土壤菌群结构及促进甘蔗生长提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验地概况
试验在广西农业科学院甘蔗研究所隆安县丁当基地进行，前茬作物为单作甘蔗。广西隆安县位于广西西南部，属南亚热带季风气候。土壤基本理化性质：pH 4.9，有机质26.1 g/kg，水解性氮108 mg/kg，有效磷5.4 mg/kg，速效钾213.0 mg/kg，全氮11.7 g/kg，全磷4.1 g/kg，全钾22.2 g/kg。
1. 2 试验材料
参试甘蔗品种为桂糖46号，猫豆为从斐济引进品种。2×Taq MasterMix、RNase-Free water、琼脂糖、TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;引物由南宁国拓生物科技有限公司合成。主要仪器设备：普通PCR仪（Biometra，德国）、Thermo Scientific NanoDrop 2000c微量分光光度计（上海奥陆生物科技有限公司）、DYY-7C核酸电泳仪（北京六一仪器厂）、GS-800凝胶扫描仪（Bio-Rad，美国）、Illumina HiSeq2500 PE250高通量测序仪（Illumina，美国）。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 试验设计及样品采集 设甘蔗单作和甘蔗间作猫豆2个处理，每处理设3次重复，共种植6个小区，每小区面积为100 m2。采用五点取样法从各试验小区采集深度0～20 cm的根际土壤样品，将五点的土样混匀，记作1份根际土壤样品。单作甘蔗为对照（CK），3个生物学重复分别标记为CK1、CK2和CK3，甘蔗间作猫豆标记为T处理，3个生物学重复分别标记为T1、T2和T3。将6份土壤样品低温保存带回实验室，去除植物碎叶等杂物。每份土壤样品再平均分成2份，分别用于土壤理化性质和土壤微生物测定。
1. 3. 2 根际土壤养分含量测定 土壤养分含量按照《土壤分析技术规范》进行测定。
1. 3. 3 基因组DNA提取及PCR扩增 采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取土壤样品的基因组DNA，并利用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。以稀释后的基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用的引物为细菌16S rDNA的V4区引物（515F和806R）和真菌ITS的ITS 1区引物（ITS5-1737F和ITS2-2043R）（李善家等，2020）。将PCR产物进行等量混样，充分混匀后使用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用胶回收试剂盒回收目的条带。
1. 3. 4 文库构建及测序数据处理 用建库试剂盒构建文库，基于Illumina HiSeq测序平台进行测序。对原始数据进行拆分、截去引物序列，利用FLASH软件对每个数据进行拼接（Mago? and Salzberg，2011）。经过严格过滤处理得到高质量的Tags数据（Clean tags）（Bokulich et al.，2012）。使用Qiime V1.7.0的Tags质控流程得到最终的有效数据（Effe-ctive tags）（Caporaso et al.，2010）。
1. 3. 5 OTU聚类和物种注释 利用QIIME V1.7.0对所有样品的Effective tags进行聚类分析，同时依据其算法原则，筛选出作为OTUs的代表序列，并进行物种注释分析（黃萍等，2020）。参照龚赛（2017）的方法进行后续Alpha多样性和Beta多样性分析。
1. 4 统计分析
采用Qiime Version 1.7.0计算Unifrac距离，并构建非加权组平均法（UPGMA）聚类树。使用R软件（Version 2.15.3）绘制PCA、PCoA和NMDS图。
2 结果与分析
2. 1 单作甘蔗与甘蔗间作猫豆的根际土壤养分含量比较结果
由表1可知，T处理的根际土壤中全氮、全钾、水解性氮、有效磷和有机质含量均高于CK的根际土壤，其中，有效磷和有机质含量分别比CK的根际土壤显著增加86.7%和16.0%（P<0.05，下同），表明甘蔗间作猫豆有利于提高甘蔗根际土壤的全氮、全钾、水解性氮、有效磷和有机质含量。
2. 2 单作甘蔗和甘蔗间作猫豆的甘蔗根际土壤微生物高通量测序结果
将在Illumina HiSeq测序平台得到的测序数据进行拼接和过滤处理，得到Clean tags，再经嵌合体过滤后得到可用于后续分析的Effective tags，对所有样品的Effective tags进行聚类分析，以97%的一致性（Identity）将其聚类成为OTUs。6份根际土壤样品的细菌16S rDNA测序结果（表2）显示，CK的平均Effe-ctive tags为156376个，聚类成3185个OTUs，T处理的平均Effective tags为186446个，聚类成3184个OTUs。6份根际土壤样品的真菌ITS测序结果（表2）显示，CK的平均Effective tags为194892个，聚类成751个OTUs，T处理的平均Effective tags为213566个，聚类成889个OTUs。说明甘蔗间作猫豆后根际土壤中细菌的不相似序列数量与单作甘蔗无显著差异（P>0.05，下同），真菌的不相似序列数量显著高于单作甘蔗。
稀释曲线可反映样品的取样深度，用以评价测序量覆盖所有类群的程度。从图1和图2可看出，土壤样品的微生物稀释曲线基本趋于平缓，但仍未达到饱和，说明取样基本合理，微生物群落结构的置信度较高，能较真实地反映土壤微生物群落构成。
2. 3 单作甘蔗和甘蔗间作猫豆的甘蔗根际土壤微生物多样性指数分析结果
土壤细菌和真菌群落多样性指数测定结果如表3和表4所示。6个土壤样品的覆盖率指数均大于0.990，表明样品中序列未被测到的概率较低，测序结果已覆盖测试样品中的绝大部分物种。CK和T处理的细菌平均ACE指数和Chao1指数均较大，且无显著差异，说明CK和T处理的甘蔗根际土壤中细菌多样性均非常丰富。与CK甘蔗根际土壤相比，T处理的甘蔗根际土壤中细菌和真菌的丰富度均有所增加。T处理的细菌和真菌平均Shannon指数显著高于CK，说明甘蔗间作猫豆会增加土壤微生物均匀度。总体来看，CK和T处理的甘蔗根际土壤中，细菌的丰富度均高于真菌;T处理的细菌丰富度高于CK，但差异不显著，T处理的细菌多样性显著高于CK;T处理的真菌丰富度和多样性显著高于CK。
2. 4 单作甘蔗和甘蔗间作猫豆的甘蔗根际土壤门水平的群落结构分析结果
由于土壤样品中所检测出的微生物种类繁多，许多种类含量极少，不能与含量多的物种表示在同一个图中，故选择排名前10名的细菌门、相对丰度大于0.001%的真菌门，以相对丰度为纵坐标，绘制柱形图。由图3可知，CK和T处理根际土壤的前10个细菌门总相对丰度分别占土壤细菌门总数的95.71%和96.27%;CK和T处理根际土壤中的主要优势细菌门为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria），其相对丰度均大于10.00%，这4个细菌门总相对丰度分别占土壤细菌门总数的81.36%和85.61%;其次为芽单胞细菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、软壁菌门（Tenericutes）和奇古菌门（Thaumarchaeota），这6个细菌门总相对丰度分别占土壤细菌门总数的14.35%和10.66%;与CK根际土壤相比，T处理根际土壤中排名前3的变形菌门、放线菌门和绿弯菌门，分别降低1.49%、1.95%和2.21%，其他细菌门分别增加0.17%～1.58%。
由图4可知，CK和T处理根际土壤中优势真菌门为子囊菌门（Ascomycota），分别占土壤真菌门总数的80.00%和92.00%，其次是担子菌门（Basidiomycota），分别占土壤真菌门总数的8.55%和6.22%，以接合菌门（Zygomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和球囊菌门（Glomeromycota）相对丰度量较少;与CK土壤样品相比，T处理根际土壤中优势真菌门子囊菌门增加12.00%，担子菌门下降2.33%。
2. 5 单作甘蔗和甘蔗间作猫豆的甘蔗根际土壤属水平的群落结构分析结果
对根际土壤前10个优势菌属相对丰度进行分析，结果如图5所示。CK和T处理根际土壤中的优势细菌属分别为水恒杆菌属（Mizugakiibacter）、游动四孢属（Luedemannella）、乳杆菌属（Acidothermus）和布氏杆菌属（Bryobacte）。但与CK根际土壤相比，T处理根际土壤样品中水恒杆菌属、游动四孢属和乳杆菌属的相对丰度分别下降2.47%、1.78%和0.68%，其他细菌属分别增加0.10%～0.86%。
对根际土壤优势真菌属相对丰度进行分析，结果如图6所示。CK和T处理根际土壤中排名前3的优势真菌属均为戴氏霉属（Taifanglania）、毛壳属（Chaetomium）和镰刀菌属（Fusarium）。且CK与T处理根际土壤中相对丰度相差较大（1.12%～2.05%）的真菌属为小蘑菇属（Micropsalliota）、鬼笔属（Phallus）、黑团孢属（Periconia）、圆孢霉属（Staphylotrichum）和裸节菌属（Talaromyces）。
2. 6 单作甘蔗和甘蔗间作猫豆的甘蔗根际土壤微生物群落的主成分分析结果
对CK和T处理的6份根际土壤样品细菌群落进行种水平上的主成分（PCA）分析，结果如图7所示。细菌群落PC1的变异为29.37%，PC2的变异为20.26%，二者的总贡献率为49.63%。如图8所示，真菌群落PC1的变异为33.44%，PC2的变异为22.73%，二者的总贡献率为56.17%。CK与T处理的细菌群落分别属于不同象限，CK位于第1和第3象限，而T处理位于第2和第4象限，表明甘蔗间作猫豆改变了根际土壤微生物群落结构。
3 讨论
甘蔗间作大豆可提高甘蔗的株高和叶长，根际土壤中碳、氮和磷含量大于单作甘蔗（卜俊瑶等，2020）。间作大豆改变土壤的pH，使其接近于中性，更适于甘蔗生长，还会增加土壤中氮的含量（农宁娟，2015）。甘蔗间作花生后0～20 cm土壤中全氮、全钾、有效磷、有机质和pH均大于单作甘蔗（唐秀梅等，2020）。宿根蔗与大豆间作可增加甘蔗有效茎数，提高甘蔗产量（覃刘东等，2019）。本研究结果也发现，甘蔗间作猫豆可有效提高甘蔗根际土壤中的全氮、全钾、水解性氮、有效磷和有机质含量，与上述研究结果相似。
土壤微生物是植物—土壤生态系统的重要组成成分，其数量及多样性对维持土壤生态系统的稳定具有重要作用，并在一定程度上体现土壤的肥力和酶活性（徐丽慧等，2017;丁丽等，2020）。其中，细菌占整个土壤微生物群落的70%～90%，真菌在土壤微生物群落中所占比例仅次于细菌（任奎瑜等，2020）。与从功能入手的传统微生物研究方法相比，高通量测序能更全面准确地从遗传物质上识别微生物的种属。本研究对甘蔗根际土壤细菌16S rRNA基因V4区域和真菌ITS 1区域进行高通量测序，结果发现，甘蔗间作猫豆后甘蔗根际土壤的Shannon和ACE指数均较单作甘蔗高，且细菌的丰富度远大于真菌的丰富度;在这2种种植模式下甘蔗根际土壤中细菌主要门类为变形菌门、放線菌门、绿弯菌门和酸杆菌门，真菌主要门类为子囊菌门和担子菌门;细菌主要优势菌属为水恒杆菌属、游动四孢属、乳杆菌属和布氏杆菌属，真菌主要优势菌属为戴氏霉属、毛壳属和镰刀菌属。彭东海等（2014）研究表明，甘蔗间作大豆后甘蔗根际土壤固氮细菌的Shannon指数高于单作甘蔗的根际土壤，可提高固氮细菌的多样性和某些固氮细菌的优势度，但对群落物种的优势度影响较小。本研究也发现，甘蔗间作猫豆后甘蔗根际土壤中细菌和真菌在门、属水平上排名靠前的优势菌群的相对丰度略微降低，而其余的优势菌略微增加，说明甘蔗间作猫豆使根际土壤中的微生物发生趋向性改变，且使各菌群结构变得均匀。目前关于间作对作物根际土壤微生物影响变化的观点不尽相同。Wang等（2012）研究发现，小麦间作豆科植物不影响小麦根际土壤微生物的群落结构;张晓岗等（2020）研究证明马铃薯间作玉米栽培后能有效改善真菌菌群结构，有害致病真菌菌属消失或比例下降，随之出现一些有益于作物生长的功能真菌;Wang等（2007）研究认为，在酸性土壤地上小麦间作芸薹属植物可改变小麦根际微生物群落结构，土壤细菌和放线菌的丰富度减少，真菌的丰富度增加。本研究中，甘蔗间作猫豆后甘蔗根际土壤中细菌和真菌的丰富度有所增加，且土壤微生物群落结构发生改变，与甘蔗间作玉米的研究结果（郑亚强等，2016）相似。根际土壤微生物群落结构改变的具体原因尚待研究。
4 结论
甘蔗间作猫豆可改善甘蔗根际的土壤养分状况，改变甘蔗根际微生物的群落结构，提高细菌和真菌的丰富度和多样性，但未影响优势菌门的排序。
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（責任编辑 陈 燕）
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