谢英花 刘朝霞 张梅梅 张冬梅
摘 要：为减轻盐酸二甲双胍对胃的刺激，实现其在肠道内的释放，以盐酸二甲双胍为主药，壳聚糖、海藻酸钠为复合载体，筛选盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球的最佳处方及制备工艺，并对其pH敏感性及体外释药特性进行了考察。通过单因素试验及正交试验优化处方工艺，利用扫描电镜进行结构表征，紫外分光光度法测定载药量及包封率，转篮法研究释放度。结果表明，盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球的优选处方如下：壳聚糖与海藻酸钠的总浓度为2%（质量体积比），海藻酸钠与壳聚糖的质量比为1∶1，药物与海藻酸钠的质量比为2∶5，氯化钙的交联浓度为3.5%（质量体积比）;盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球在人工胃液中6 h累积释放度小于4%，在人工肠液中6 h累积释放度最大可达96.4%。所制备的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球处方工艺稳定可靠，水凝胶微球机械强度高，生物降解性和稳定性好，是一种新型结构的盐酸二甲双胍给药系统。
关键词：药剂学;盐酸二甲双胍;海藻酸钠/壳聚糖;pH敏感性;水凝胶;微球
中图分类号：O175.8;R944 文献标识码：A
文章编号：1008-1542（2021）01-0060-07
盐酸二甲双胍为双胍类口服降糖药，多年来一直是肥胖及2型糖尿病患者的首选用药[1]，但盐酸二甲双胍的生物半衰期较短（2～3 h），一般需要大剂量使用或频繁给药（2～3次/d），因而易产生一定程度的不良反应，常见为胃肠道不良反应（如恶心、呕吐、食欲减退等）[2-3]。研究表明，口服盐酸二甲双胍在胃中吸收较少，主要在小肠的中上部吸收（即十二指肠和空肠，结肠段吸收较少）[4]。为减轻盐酸二甲双胍对胃的刺激，实现其在肠道内释放，本实验以盐酸二甲双胍为主药，壳聚糖、海藻酸钠为复合载体，制备盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球，并对其pH 敏感性及体外释药特性等进行考察，以期获得一种新型结构的盐酸二甲双胍给药系统。
1 实验材料
1.1 仪器
DF-1010S型集热式恒温加热磁力搅拌器，河南巩义市予华仪器有限责任公司提供;101-2A型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司提供;ZRS-8G智能溶出测试仪，天津市鑫洲科技有限公司提供;Genesys 10s UV-VIS紫外可见分光光度计，赛默飞世尔科技公司提供;AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司提供;KQ5200B型超声波清洗器，江苏昆山市超声仪器有限公司提供;LGJ-10冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂提供;烧杯，玻璃棒，表面皿，濾膜，滤器，注射器等。
1.2 试剂
海藻酸钠，天津市博迪化工有限公司提供;盐酸二甲双胍，山东科源制药有限公司提供;无水氯化钙，天津市永大化学试剂有限公司提供;冰乙酸，天津市永大化学试剂有限公司提供;壳聚糖，国药集团化学试剂有限公司提供，脱乙酰度≥90.0%;磷酸二氢钾，天津市永大化学试剂有限公司提供;氢氧化钠，天津市大陆化学试剂厂提供;盐酸，国药集团化学试剂有限公司提供;实验用水为蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 盐酸二甲双胍分析方法的建立
按紫外分光光度法，在200～400 nm范围内扫描。发现盐酸二甲双胍在233 nm处有最大吸收，所用辅料在此无吸收，故选择233 nm作为测定波长。盐酸二甲双胍在2.0～15.0 μg/mL范围内，吸光度（Y）与药物浓度（X）线性关系良好，回归方程为Y=0.074X+0.001 7，R2=0.999 9（n=6），精密度RSD值为0.28%（n=5），回收率RSD值为0.56%（n=6），稳定性试验RSD值为0.37%（n=6）。结果表明，该分析方法快速、准确、灵敏度高、重复性好。
2.2 单因素试验
2.2.1 制备工艺
混合液Ⅰ：精密称量适量海藻酸钠，放入烧杯中加入蒸馏水，在恒温磁力搅拌下至全溶，然后加入盐酸二甲双胍，继续搅拌至全溶。
混合液Ⅱ：将1 mL乙酸溶于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，配制成体积分数为2%的乙酸溶液。将适量壳聚糖加入配好的乙酸溶液中，恒温磁力搅拌下至全溶。
根据相关文献，进行了3种制备工艺的筛选。
工艺1 将适量体积的溶液Ⅰ和Ⅱ混合，恒温磁力搅拌30 min，得到混合液Ⅲ。将适量氯化钙溶于200 mL蒸馏水中，全溶后，将混合液Ⅲ用注射器滴入氯化钙水溶液中，滴完搅拌10 min，静置30 min，过滤，水洗，干燥。
工艺2 在混合液Ⅱ中加入适量氯化钙，得到混合液Ⅲ，在搅拌条件下，将混合液Ⅰ缓慢滴加到混合液Ⅲ中，滴加完毕后，搅拌10 min，过滤，水洗，干燥。
工艺3 在搅拌条件下，将混合液Ⅰ缓慢滴加到混合液Ⅱ中，混合均匀后，加热30 min，加入适量氯化钙，快速搅匀，密封，静置。
观察所得产品外观发现：工艺1可得到外形较好的凝胶球，外观形态见图1;工艺2和工艺3得到的产品几乎不分层，不易分离得到水凝胶，因此按工艺1进行盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球的制备。
2.2.2 干燥方法
盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球经室温或烘箱干燥后为微黄色水凝胶颗粒，结构较紧密，硬度较大，形状不规则。而经真空冷冻干燥后，水凝胶球呈白色，结构较疏松，基本保持球形，未发生明显的皱缩。由于冷冻干燥制品的体积基本不变，极易溶于水而恢复原状，可在最大程度上防止干燥物质理化和生物学方面的变性，故选用真空冷冻干燥方法进行盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球的制备。
2.2.3 壳聚糖与海藻酸钠的总浓度（质量体积比，下同）
以壳聚糖与海藻酸钠的总浓度为变量，其他因素不变，按照优选工艺1制备盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球。结果显示：壳聚糖与海藻酸钠的总浓度为1%时，所得水凝胶较稀，滴加呈无定形态;2%时，可得凝胶微球，外形较圆整;3%时，可得成形性较好的凝胶微球，且弹性增加;4%时，壳聚糖溶解时间延长，所得水凝胶黏稠度增加，凝胶球较好;5%时，所得到的壳聚糖溶液含有未溶解的小块，得到的混合溶液黏稠度太大，无法滴加形成凝胶微球。综上所述，確定海藻酸钠与壳聚糖的总浓度考察范围为2%～4%。
2.2.4 海藻酸钠与壳聚糖的质量比
以海藻酸钠和壳聚糖的质量比为变量，其他因素不变，按照优选工艺1制备盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球。结果显示：海藻酸钠和壳聚糖的质量比为1∶3时，所得凝胶微球颜色发白，形状不规则，成形性较差;质量比为1∶2时，所得凝胶微球成形性仍较差，大小不均一;质量比为1∶1时，可得到完整的凝胶微球，外形较圆整;质量比为2∶1时，得到的凝胶微球成形性较好，弹性较1∶1时增强;质量比为3∶1时，得到的混悬液黏稠度降低，凝胶微球的颜色偏淡黄色，基本符合要求;质量比为4∶1时，得到的混悬液黏稠度降低，较难得到凝胶微球。综上所述，确定海藻酸钠与壳聚糖的质量比考察范围为1∶1～3∶1。
2.2.5 氯化钙浓度（质量体积比，下同）
以氯化钙浓度（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.5%，4.0%，4.5%）为变量，其他因素不变，按照优选工艺1制备盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球。结果显示，氯化钙浓度范围为1.5%～3.5%时，所得凝胶微球的成形性及弹性较好。
2.3 正交试验
2.3.1 因素与水平
以壳聚糖与海藻酸钠总浓度（A）、海藻酸钠与壳聚糖质量比（B）、药物与海藻酸钠质量比（C）、氯化钙浓度（D）为考察因素，各因素水平设计见表1，依照L9（34）正交表进行试验，以药物包封率、载药量及pH敏感性为评价指标，对处方进行优选，确定最佳参数。载药量=（m凝胶中包封药物/m干燥水凝胶）×100%，包封率=（m凝胶中包封药物/m处方药物）×100%，pH敏感性=（C3 h肠液中药物-C3 h胃液中药物）/C8 h肠液中药物×100%，综合评分=包封率×0.35 +载药量×0.35+ pH敏感性×0.30。
2.3.2 正交试验结果
正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。
由表2可知，各因素的影响顺序为B>A>D>C，最佳处方为A1B1C1D3，即壳聚糖与海藻酸钠的总浓度为2%，海藻酸钠与壳聚糖的质量比为1∶1，药物与海藻酸钠的质量比为2∶5，氯化钙的交联浓度为3.5%。由表3可知，4种因素对载药量、包封率及pH敏感性均无显著性影响。按优选的处方制备3批样品，进行验证试验，结果如表4所示。
2.4 盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球的性能研究
2.4.1 电镜扫描
将制备的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球先预冻2 h，然后放入真空干燥机中，干燥24 h，得到疏松白色干燥的水凝胶颗粒，在扫描电镜下观察发现，盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球形态较好，凝胶球表面不平整，有皱褶，部分有凹陷，电镜照片如图2所示。
2.4.2 溶胀性能观察
称取一定量的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球，分别置于人工胃液（pH值为1.5）和人工肠液（pH值为6.8）中，隔一定时间取出（用滤纸吸干凝胶微球表面的水分）称重，计算其溶胀度（SR），SR=（m-m0）/m0×100，其中m为溶胀后水凝胶微球质量（g），m0为溶胀前水凝胶微球质量（g）。结果如图3所示。
由图3可知，所制得的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球在人工胃液中的溶胀度在204%～251%范围内，而在人工肠液中，随着溶胀时间的延长，溶胀度明显增大，在4 h时可达3 389%，说明所制得的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球具有良好的pH敏感性。
2.4.3 不同pH环境下体外药物溶出研究
参照《中华人民共和国药典》2015年版中溶出度与释放度测定法进行盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球的体外释放度试验，分别以pH值1.5，2.5，4.5，6.8，7.4和8.0的磷酸盐缓冲溶液为溶出介质，精密称取一定量盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球，置于溶出介质中，每隔一定时间取样，测定累积释放度，结果如图4所示。
由图4可知，盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球在不同pH磷酸盐缓冲溶液中的累积释放度差异明显，在酸性条件下6 h累积释放度小于20%，而在碱性条件下6 h累积释放度均大于80%，其中在pH值为6.8的磷酸缓冲溶液中6 h累积释放度最大可达97.3%。这说明所制得的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球具有良好的pH敏感性。
2.4.4 药物在模拟胃肠环境中的连续释放研究
精密称取一定量的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球和盐酸二甲双胍肠溶片，首先置于模拟人工胃液（pH值为1.5）中4 h，然后转移至模拟人工肠液（pH值为6.8）中8 h，定时取样测定其释放情况。结果如图5所示。
由图5可知，盐酸二甲双胍肠溶片和盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球在人工胃液中4 h的平均累积释放度小于4%，转移到人工肠液中，盐酸二甲双胍肠溶片1 h即达到98%的最高累积释放值，盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球6 h达到96.4%的最高累积释放值。因此，本实验制备的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球具有明显的pH敏感性，释放曲线平缓，可以作为pH敏感性肠道释药系统，持续、稳定释放药物。
3 讨论与结论
1）pH敏感性水凝胶是指可随外界pH值变化改变其溶胀或消溶胀作用的凝胶[5-6]，能根据人体胃肠道pH值递增的特点收缩或溶胀，控制药物在体内的释放[7-8]。水凝胶微球机械强度高，生物降解性、稳定性好，是很有前途的缓控释给药载体。
2）本实验以壳聚糖、海藻酸钠为载体，制备了盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球。海藻酸钠为天然存在的多糖，具有生物相容性和生物降解性特点[9]，并对pH值等条件敏感，作为药物载体广泛应用于药学、食品、生物技术等领域[10-11]。在溶液状态下，海藻酸钠能与金属离子如Ca2+等发生化学反应，金属离子将Na+置换出来，并将海藻酸钠的长分子链维系在一起形成凝胶。海藻酸钠液滴与氯化钙形成海藻酸钙凝胶微球的过程是溶胶-凝胶相转移过程。但单一的海藻酸钙凝胶机械性能差、易降解，遇水会大量溶胀，导致不可控制和药物活性成分的释放。为了增强凝胶强度，更好地控制药物释放，可引入壳聚糖对海藻酸钙凝胶进行处理。海藻酸盐的分子链上有大量羧基，是阴离子聚合物，与阳离子聚合物结合时会发生复合凝聚，形成复合凝胶[12]。而直链聚阳离子多糖壳聚糖无毒，生物相容性好，易生物降解，具有良好的成膜性，其侧链结构中含有大量的伯氨基[13-18]。因此，海藻酸钠可以与壳聚糖通过静电相互作用形成复合凝胶。该凝胶在人工胃液中处于收缩状态，负载的药物释放速度慢，释放量较少，但在人工肠液中吸水溶胀，药物释放速度较快，释放较完全，可实现药物的控制释放[19-22]。
3）本實验在单因素试验基础上，以包封率、载药量及pH敏感性的综合评分为指标，通过正交试验筛选出了盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球的最佳处方，按照最佳处方制备的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球的载药量、包封率及pH敏感性较高，处方与工艺重复性良好。体外释放度试验显示，制备的盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球在人工胃液中4 h的平均累积释放度小于4%，服用后可有效减少药物在胃部的释放;转移到人工肠液中，盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球6 h平均累积释放度达到96.4%，表明药物转运至肠道碱性环境后可以实现持续、稳定释放。
4）本实验根据盐酸二甲双胍的特点制备了pH敏感性水凝胶微球，使盐酸二甲双胍在胃中不释放，进入小肠后缓慢释放，减轻了药物对胃的刺激，提高了药物疗效，降低了不良反应，具有重要的临床意义。然而，本研究尚未对盐酸二甲双胍pH敏感性水凝胶微球经口服后在体内的释放规律进行探索，有待今后加以深入研究。
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