都宏霞 石巾艺 王冬娥
摘要： 為探究绿色低共熔溶剂提取互叶白千层精油的最佳工艺，该研究采用四种提取工艺作对比，并在单因素实验的基础上结合响应面进行了工艺优化，利用气相色谱-质谱法（GCMS）对四种工艺提取到的互叶白千层精油进行了比较分析。结果表明：（1）互叶白千层精油最佳提取工艺为干燥原料低共熔溶剂蒸馏，最优提取条件为氯化胆碱与1，3丁二醇摩尔比1∶3、含水量52 mol、原料干燥时间9 h、料液比1∶5 g·mL1、蒸馏时间60 min，在此条件下所得提取率为4.06%，实验值与响应面模型的预测值有较好的拟合性，证实模型有效，提取率比新鲜原料水蒸气蒸馏、干燥原料水蒸气蒸馏和冻融原料水蒸气蒸馏分别提高了383.33%、290.38%和497.06%。（2）经四种工艺提取所得精油主要成分大致相同，但含量差距很大，主要有醇类和烯烃类物质。（3）干燥原料低共熔溶剂蒸馏的精油提取率和特征组分含量都高于其他工艺，包括醇类8种，烯烃类9种，其他化合物3种;主要成分为γ松油烯、松油烯、α蒎烯、α松油醇、香树烯，其中烯烃类化合物相对含量最大，为45.31%;特征组分松油烯4醇含量为30.58%，桉叶油醇为0.12%。该研究为互叶白千层的资源开发和天然产物的绿色提取提供了数据支撑。
关键词：
互叶白千层， 精油， 低共熔溶剂， 提取， 成分分析
中图分类号： Q946; R284文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2022）05-0762-10
Extraction and component analysis of essential oil of
Melaleuca alternifolia by green deep eutectic solvents
Abstract： In order to explore the best extraction process of essential oil of Melaleuca alternifolia by green deep eutectic solvents， four different extraction processes were compared including freshsteam distillation extraction， drysteam distillation extraction， freeze thawingsteam distillation extraction and deep eutectic solventsdistillation extraction. The effects of liquidmaterial ratio， distillation time， molar ratio of deep eutectic solvents， raw material drying time， water content on extraction rate of essential oil of M. alternifolia were investigated by single factor test. Based on singlefactor tests， the quadratic regression parasitism model was established through the response surface methodology. The essential oil of M. alternifolia was determined by gas chromatographymass spectrometry （GCMS）. The results were as follows：
（1） Deep eutectic solventsdistillation extraction was the best extraction processes. The optimal extraction conditions were determined to be molar ratio of choline chlorid to 1，3Butanediol 1∶3 （mol∶mol）， water content 52 mol， drying time of raw materials 9 h， materialliquid ratio 1∶5 g·mL1， distillation time 60 min， and the maximum extraction rate of essential oil of M. alternifolia reached 4.06%， which was 383.33%， 290.38% and 497.06% higher than that of freshsteam distillation extraction， drysteam distillation extraction and freeze thawingsteam distillation extraction， respectively. Response surface methodology was proved to be applicable for extraction of essential oil from M. alternifolia， the experimental results were in good agreement with the predicted values of the response surface model. （2） The main components of essential oil of M. alternifolia extracted by four different extraction processes were proved to be almost same， while the contents were signifcanthy different. （3） Alcohols and alkenes were confirmed to be the main components in the essential oil of M. alternifolia. The extraction yield and characteristic component content of essential oil of M. alternifolia extracted by deep eutectic solventsdistillation were indicated much higher than those by other three processes，which including eight alcohols， nine alkenes and three other compounds， with the main components of γTerpinene，αTerpinene，αPinene，αTerpineol and alloaromadendrene， and the relative content of alkenes was 45.31%， the content of Terpinen4ol and eucalyptol was 30.58% and 0.12%. This study provides the data supporte for the further utilization of M. alternifolia and green extraction of natural products.A43FB958-7B00-4367-B44C-5771A1445525
Key words：
Melaleuca alterniflora， essential oil， deep eutectic solvents （DESs）， extract， component analysis
植物精油作为一种高附加值的产品，呈现出非常广阔的市场前景。目前，精油的提取方法主要有有机溶剂萃取法、索氏提取法、压榨法、水蒸气蒸馏法、超临界CO2萃取、生物酶提取、微波辅助提取和超声波辅助提取等（Gonzalezmas et al.， 2019;段云博， 2020）。这些提取方法都存在着环境污染、高能耗、生产成本高、产率低等缺点。因此，需要一种绿色、高效、环境友好的提取方法。
绿色化学一直是国际学术研究的前沿领域和研究热点。随着人们对绿色环保、健康生活的重视，绿色提取势在必行。低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DESs）是Abbott等人首次合成的一类绿色新型提取溶剂（Abbott et al.， 2003），一经报道立刻引起国际上众多领域的广泛关注（Bajkacz & Adamek，2017;Liu et al.， 2018）。DESs是由两种或多种安全无毒的成分作为氢键受体（HBAs）和氢键供体（HBDs），通过分子间氢键结合而成。因此，DESs比传统溶剂的熔点低、密度大、黏度大、表面张力大、溶解度大，并且能够与溶质间形成较强的分子间氢键使其萃取能力远高于传统溶剂（Dai et al.， 2014;Dai et al.， 2016;陈冉等，2019）。DESs还具有成本低、易制备、安全无毒、生物可降解、环境友好等特点，目前DESs已在天然植物提取分离方面有报道，具有巨大潜力（Fernandez et al.， 2018;Chandran et al.， 2019;李利芬等，2020），但在精油提取方面研究甚少。将DESs这种绿色溶剂用于探索精油提取是一种新的趋势，在保护环境的同时，能够提高提取效率，同时为DESs在绿色提取领域的应用提供新的数据支撑。
互叶白千层（Melaleuca alternifolia）是桃金娘科白千层属植物，主产于澳大利亚东南沿海，也叫澳洲茶树，其枝叶可以用来提取精油，即互叶白千层精油（essential oil of Melaleuca alterniflora，EOMA），也称茶树精油，研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等方面的活性作用（宋吉明等，2019;石金娥等，2019;Capetti et al.， 2020），目前报道的提取方法有水蒸气蒸馏、有机溶剂提取法、超临界提取法（肖凯军等，2000;Kong et al.， 2020），这些方法广泛用于医药、日化、生物农药、食品等领域，所以通过绿色低共熔溶剂进一步探索优化其提取工艺非常有意义。
本文基于绿色提取的理念，采用低共熔溶剂提取EOMA，并通过响应面法对EOMA进行优化，旨在开发一种绿色、高效、经济、环保的EOMA新型提取方法，更好地促进精油产业的发展，为天然产物的开发提供数据支撑。
1材料与方法
1.1 实验原料和试剂
原料：采自浙江丽水，经南京林业大学罗曼博士鉴定为互叶白千层。采集部位为新萌发带叶枝条，采集时间为2019年11月。
试剂：NaCl（分析纯，国药集团）;甜菜碱盐酸盐（山东优索）;蔗糖（分析纯，国药集团）;1，3丁二醇（广州科源）;无水甜菜碱（山东优索）;氯化胆碱（阿拉丁）。
1.2 主要仪器
ME204E02型电子天平 [梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司];DHG9075A型鼓风干燥箱（上海鳌珍）;Trace1300ISQ7000 GCMS联用仪（赛默飞世尔科技公司）;调温电热器（通州申通电热器厂）;FW177型中草药粉碎机（泰斯特）。
1.3 实验研究方法
1.3.1 DES的制备参考Abbott的方法（Crawford et al.， 2016），以氯化胆碱为氢键受体、1，3丁二醇为氢键供体，按摩尔比1∶3，在含水量50 mol、80 ℃水浴加热的条件下搅拌，直至溶液澄清，冷却至室温，得到DES备用。
1.3.2 EOMA提取率计算
Y=m1/m2 × 100%。
式中：Y为EOMA提取率（%）;m1为EOMA的质量（g）;m2为互叶白千层原料质量（g）。
1.3.3 EOMA提取工艺的比较将新鲜的互叶白千层枝条洗净阴干，摘取枝条尖端5～10 cm枝叶，将原料进行处理，处理条件见表1，粉碎。准确称取原料30.0 g至500 mL圆底烧瓶中，加入溶剂（H2O或DES）90.0 mL，搭建蒸馏装置，开启冷凝水，加热至沸腾并保持持续沸腾状态，通过新鲜原料水蒸气蒸馏（freshsteam distillation extraction，FSDE）、干燥原料水蒸氣蒸馏（drysteam distillation extraction，DSDE）（Mokhtarikhah et al.， 2020）、冻融原料水蒸气蒸馏（freeze thawingsteam distillation
extraction，FTSDE）（张蕾等，2010）和低共熔溶剂蒸馏（deep eutectic solventsdistillation extraction，DESDE）4种工艺提取EOMA，时间均为44 min，将馏出液于分液漏斗中静置、分液，取上层液在-5 ℃下冷冻去除水分，即得EOMA，称重计算。
1.3.4 DESDE提取EOMA的单因素实验本研究考察了料液比、蒸馏时间、DES摩尔比、原料干燥时间和DES含水量5个因素对EOMA提取率的影响。
1.3.4.1 料液比对EOMA提取率的影响在蒸馏时间44 min、氯化胆碱和1，3丁二醇摩尔比1∶3、DES含水量50 mol、原料干燥4 h的条件下，以料液比为1∶3、1∶5、1∶10、1∶20 g·mL1作为变量，研究料液比对EOMA提取率的影响。A43FB958-7B00-4367-B44C-5771A1445525
1.3.4.2 蒸馏时间对EOMA提取率的影响在氯化胆碱和1，3丁二醇摩尔比1∶3、料液比1∶5 g·mL1、DES含水量50 mol、原料干燥4 h的条件下，以蒸馏时间30、45、60 、90、120 min为变量，探讨蒸馏时间对EOMA提取率的影响。
1.3.4.3 DES摩尔比对EOMA提取率的影响在蒸馏时间60 min、料液比1∶5 g·mL1、原料干燥4 h、 DES含水量50 mol的条件下，以氯化胆碱和1，3丁二醇摩尔比分别为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5作为变量，研究摩尔比对EOMA提取率的影响。
1.3.4.4 原料干燥时间对EOMA提取率的影响在蒸馏时间60 min、料液比1∶5 g·mL1、氯化胆碱和1，3丁二醇摩尔比1∶3、DES含水量50 mol的条件下，以原料干燥时间2、4、6、8、10、12 h作为变量，研究原料干燥时间对EOMA提取率的影响。
1.3.4.5 DES含水量對EOMA提取率的影响在蒸馏时间60 min、料液比1∶5 g·mL1、原料干燥时间8 h、氯化胆碱和1，3丁二醇摩尔比1∶3的条件下，以DES含水量为30、40、50、60、70 mol作为变量，研究DES含水量对EOMA提取率的影响。
1.3.5 EOMA提取条件优化在单因素实验结果的基础上设计响应面实验。利用BBD设计原理设计响应面优化实验方法，以摩尔比（A）、干燥时间（B）、含水量（C）三种影响因素为自变量，提取率（Y）为响应值，设计出三因素三水平的响应面进行分析实验与统计分析，实验设计因素与水平如表2。
1.3.6 EOMA成分分析
1.3.6.1色谱条件色谱柱：TG5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。升温程序：50 ℃保持1 min，以10 ℃·min1升至250 ℃，保持9 min。载气流速：1.0 mL·min1，进样量1 μL;不分流进样。
1.3.6.2 质谱条件电子轰击离子源;电子能量70 eV;传输线温度250 ℃;离子源温度300 ℃;质量扫描范围50～500 m·z1，溶剂延迟4 min。
2结果与分析
2.1 EOMA提取工艺的比较
EOMA提取工艺的比较结果如图1。从图1可以看出，低共熔溶剂蒸馏相比其他工艺对于EOMA的提取率较高，为2.85%。可能因为1，3丁二醇的醇基分支少，内部空间大（黄秀红等，2020），形成的DES体系粘度较小，对细胞壁的渗透性较好（白有灿，2018;孔方等，2020），所以可以更好地促进精油成分的有效释放，因此本文采用DESDE为提取工艺，进行进一步的优化研究。
2.2 单因素实验结果
2.2.1 料液比对EOMA提取率的影响结果如图2所示，料液比在1∶5时，EOMA提取率最高，为2.48%。随着溶剂用量不断增大，提取率逐渐减小，因为在料液比为1∶5时足以彻底进行水散作用，随着液料比的升高，其他成分的溶出也相对增多，所以抑制精油有效成分析出，从而导致提取率下降（王会全等，2018）。因此，最佳料液比为1∶5。
2.2.2 蒸馏时间对EOMA提取率的影响结果如图3所示，随着蒸馏时间增加，EOMA提取率逐渐上升，60 min时，提取率最高，为2.91%，随后提取率下降。刚蒸馏时，原料中易挥发组分快速溶出，提取率不断增加，当蒸馏时间超过60 min时，精油有效成分挥发或分解，导致精油提取率下降（张学彬等，2019）。因此，最佳蒸馏时间为60 min。
2.2.3 DES摩尔比对EOMA提取率的影响结果如图4所示，随着HBD摩尔比增大，EOMA提取率上升，当HBA和HBD摩尔比为1∶3时提取率最高，为2.91%，之后提取率下降，可能因为HBD摩尔比增大，与HBA结合产生的氢键增多，溶液体系稳定，所以利于精油提取。因此，最佳摩尔比为1∶3。
2.2.4 原料干燥时间对EOMA提取率的影响结果如图5所示，随着原料干燥时间的增加，EOMA提取率不断上升，当干燥时间为8 h时提取率最高，为4.75%，干燥时间超过8 h，EOMA提取率下降。互叶白千层在前8 h干燥过程中散失的是水分，干燥时间增加，相同质量原料用量逐渐增大，EOMA提取率提高，之后由于长时间高温导致精油有效成分散失，导致提取率下降。因此，最佳干燥时间为8 h。
2.2.5 DES含水量对EOMA提取率的影响结果如图6所示，EOMA的提取率随着DES含水量的增大而增加，当含水量为50 mol时，提取率最高，为4.75%。主要原因是含水量对DES体系的粘度影响很大，少量水可使DES粘度降低，从而提取率提高，当含水量超过50 mol后，体系粘度过低极性过大，可能导致其分子间氢键断裂，从而使超分子结构丢失，最终导致提取率下降（Dai et al.， 2015）。
2.3 响应面优化结果分析
2.3.1 响应面优化实验设计结果及方差分析根据单因素实验结果，把摩尔比（A）、干燥时间（B）、含水量（C）作为优化参数，以提取率为相应值（Y），根据BBD设计原理进行响应面分析，结果如表3所示。
利用DesignExpert软件对实验数据进行分析，得到二次多项回归方程：
R=4.06+0.019A+0.39B+0.29C+0.025AB+0.13AC+0.065BC-1.28A2-1.01B2-0.78C2。
式中：R为提取率;A、B和C分别为对应摩尔比、干燥时间和含水量的编码。
由表4的数据可知：模型的P值为0.000 5，模型极显著（P<0.01）;失拟项P值为0.838 7，结果不显著（P>0.05），表明拟合状况良好。方程决定系数R2 =0.984 6，CV为8.18%<10%，能真实地反映本模型，可用此模型分析响应面的变化。信噪比（Adeq Precision）为16.619，大于4，表示模型合理。A43FB958-7B00-4367-B44C-5771A1445525
由方差F值可知，各因素對提取率影响为B（干燥时间）>C（含水量）>A（摩尔比）。由表4可知，因素B、C、A2、B2、C2 的影响极显著（P<0.01），而A、AB、AC、BC的影响不显著，该方程可适用。
2.3.2 响应面交互作用分析各因素间交互作用得到响应面曲线图。图7、图8、图9分别显示3个结果分析，并绘制响应面曲线图。
响应曲面坡度越大表示因素对响应值影响越大（鹿浩志等，2019）。分析图7、图8、图9，摩尔比和干燥时间响应曲面坡度大，交互作用显著。摩尔比和含水量响应曲面坡度较大，交互作用较为显著。含水量与干燥时间响应曲面较为平缓，交互作用不够显著。这与方差分析结果保持一致。
为进一步优化结果，根据DesignExpert软件得出在摩尔比、干燥时间和含水量交互作用影响下，最优提取工艺：摩尔比为1∶3.04，干燥时间为8.81 h，含水量为51.99 mol，在此条件下模型预测的提取率为4.13%，结合实验室实际，修正条件摩尔比为1∶3，干燥时间为9 h，含水量为52 mol，提取率为4.06%，与预测值相差0.07%，实验值与预测值有较好的拟合性，证实模型有效。
2.4 GCMS仪对EOMA成分分析
使用GCMS对DESDE与FSDE提取的EOMA精油进行成分分析，利用NIST质谱库-计算机联机检索，确定各组分名称，其分析结果见表5。由表5可知，DESDE与FSDE提取的精油主要成分大致相同，但含量有差异。DESDE提取的EOMA中醇类8种、烯烃类9种、其他化合物3种，其中特征组分松油烯4醇含量为30.58%，桉叶油醇为0.12%，主要成分为γ松油烯（10.78%）、松油烯（10.06%）、α蒎烯（9.59%）、α松油醇（7.94%）、香树烯（4.52%），其中烯烃类化合物相对含量最大，为45.31%。FDES提取的EOMA中，醇类6种、烯烃类化合物9种、其他化合物5种，其中特征组分松油烯4醇含量为24.12%、桉叶油醇未检出，主要成分为γ松油烯（13.91%）、α松油醇（13.36%）、松油烯（5.47%），其中烯烃类相对含量较少，为31.73%，醇类相对含量较大，为47.03%。FTSDE提取的EOMA中，醇类5种、烯烃类6种、其他化合物4种，其中特征组分松油烯4醇为1.97%、桉叶油醇未检出，主要成分为双环橡胶（20.06%）、β桉叶醇（17.49%）、（+）表古酚（17.24%），其中烯烃类相对含量较少，为24.95%，醇类相对含量较大，为29.44%。DSDE提取的EOMA中，醇类4种、烯烃类7种、其他化合物2种，其中特征组分松油烯4醇为4.67%、 桉叶油醇表 4提取率响应面拟合回归方程的方差分析结果
未检出，主要成分为绿花白千层醇（30.83%）、β桉叶醇（18.41%）、香树烯（12.64%），其中烯烃类相对含量较少，为29.61%，醇类相对含量较大，为61.95%。通过DESDE提取所得的特征组分松油烯4醇含量均高于其他工艺。因为DES的溶解度比水大，并且能够破坏互叶白千层植物细胞表面上的纤维素结构，所以在提取过程中能有效促进细胞内更多挥发性化合物释放到DES当中，进而随着蒸馏进入到气相中，再经冷却和分离得到更多的精油。而且，经过单因素和响应面优化实验得到的DES具有合适的含水量和摩尔比，DES体
系的粘度和极性都处于互叶白千层精油提取的最佳条件，同时DES又与醇类和烯烃类等精油成分间形成了较强的分子间氢键，使其提取能力远高于传统的水溶剂。
3讨论与结论
本研究采用低共熔溶剂，建立了一套干燥原料低共熔溶剂蒸馏提取互叶白千层精油的工艺。基于单因素结合响应面优化实验得到最优提取条件：DES摩尔比1∶3，原料干燥时间9 h，DES含水量52 mol，在此条件下EOMA的提取率为4.06%，比FSDE、DSDE和FTSDE分别提高了383.33%、290.38%和497.06%，充分表明了响应面模型的有效性和DESDE提取工艺的高效性。通过GCMS对四种工艺提取得到的EOMA进行了分析，精油主要成分大致相同，但含量有差异，主要包含醇类和烯烃类物质。经过优化的DES体系粘度、极性及对EOMA的溶解度都高于传统的水溶剂，因此通过DESDE提取的EOMA提取率和特征组分含量都高于其他工艺，包括醇类8种、烯烃类9种、其他化合物3种;主要成分为γ松油烯、松油烯、α蒎烯、α松油醇和香树烯，其中烯烃类化合物相对含量最高，为45.31%;特征组分松油烯4醇含量为30.58%，桉叶油醇为0.12%。
目前，不同文献报道的互叶白千层精油提取率和组分差异较大。肖凯军等（2000）通过水蒸气蒸馏法提取， 精油提取率为1%，比本研究DESDE少3.06%;刘义军等（2019）对不同成熟度、干燥方法的互叶白千层精油进行了提取分析，证实嫩叶和老叶的精油提取率分别为4.52%和3.25%，通过GCMS分析得到15种组分，其中嫩叶和老叶精油组分松油烯4醇含量分别为38.34%和 38.06%，桉叶油醇分别为0.97%和1.36%，其提取率与DESDE提取率相近，主要精油组分也一致，但组分种类比DESDE少5种。贾芬等（1995）采用水蒸汽蒸馏提取结合GC/MS/DS分析，得到25种组分，比本研究多;石金娥等（2019）采用顶空-气相色谱/质谱法测定了互叶白千层精油，得到13种组分，比DESDE少，松油烯4醇和桉叶油醇相对含量为 34.9%和 4.91%。由此可见，互叶白千层精油提取率和组分的差异与原料、提取方法、实验条件和检测设备都有关系。
互叶白千层资源广泛，已有研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化作用（宋吉明等，2019;石金娥等，2019;Capetti et al.， 2020），而且在医药、日化、生物农药、食品等领域都有着广泛应用，有较大的开发价值。因此，深入分析其活性成分、活性作用及药理作用，对互叶白千层资源开发和利用都有重要意义。本研究为互叶白千层的开发提供了数据支撑，同时为其他天然产物的绿色开发提供了技术支持。A43FB958-7B00-4367-B44C-5771A1445525
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（责任编辑李莉）
基金项目： 江苏省高校优秀科技创新团队（201731）;南京科技职业学院科研课题
第一作者：
都宏霞（1981-），博士，副教授，主要研究方向为天然产物提取及水处理，A43FB958-7B00-4367-B44C-5771A1445525
