郑钰铮 邱志伟 黄艳峰 叶香兰 谢新宇 付长龙
【摘 要】 类风湿关节炎的治疗方法颇多，但以改善病情、缓解临床症状为主。山柰酚是从姜科植物山柰的根茎提取的黄酮醇类化合物，具有抗氧化、抗炎及免疫调节等作用，尤其在干预类风湿关节炎的病理进程方面已成为研究热点之一。探讨山柰酚治疗类风湿关节炎的作用机制，以期为山柰酚对类风湿关节炎治疗的进一步研究提供思路。
【关键词】 类风湿关节炎;山柰酚;免疫调节;抗氧化;信号通路;作用机制类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种
慢性全身性自身免疫病，严重影响患者的生活质量。RA的临床表现主要为关节僵硬（尤其晨起时）、关节压痛、关节肿胀畸形及类风湿结节等。RA任何年龄都可以发生，但多发病于30～50岁，男女发病率不同，以女性较高[1-2]。RA早期以关节滑膜炎症状为主，若病情反复发作，不断进展，至晚期则表现为受累关节处的软骨损伤、骨侵蚀及关节功能障碍。RA一旦发病，很难逆转损伤。晚期RA对关节的严重破坏是造成患者残疾的重要原因[3]。因此，改善RA病情，缓解其病理进程是当前亟需解决的关键问题之一。
山柰酚（3，4，5，7-四羟黄酮）是一种从山柰中提取的具有活性作用的黄酮醇类化合物。山柰酚具有抗氧化损伤、抗炎、免疫调节及类雌激素作用等多种药理活性，对RA、糖尿病、骨质疏松以及心血管等疾病具有防治作用[4]。
1 山柰酚对RA作用机制的研究
近年来，山柰酚治疗RA的研究已成为新的热点，但其治疗RA的作用与潜在机制尚需要进行系统性阐明。为此，本文对山柰酚治疗RA的作用机制进行初步探讨。
1.1 免疫调节作用 调节性T细胞（Treg细胞）是T细胞亚群中的一种，具有免疫抑制作用。诱导型调节性T细胞（iTreg细胞）和天然调节性
T细胞（nTreg细胞）均属于Treg细胞，表性特征均为CD4+CD25+Foxp3+[5]。辅助性T细胞17（Th17细胞）是CD4+T细胞，Th17细胞自身能表达转录因子维A酸相关孤独受体γt（RORγt）。该受体通过接受转录因子和信号传导等的激活后，分泌白细胞介素（IL）-17等多种细胞因子，参与自身免疫作用[6-7]。Th17细胞和Treg细胞在免疫调节方面起着一正一反的作用，两者的生成和凋亡处于一个相对恒定的状态，是机体维持正常免疫活动的重要基础。而RA患者体内出现Th17/Treg细胞作用能力不对等，Th17细胞数量增加，而Treg细胞数量减少，Th17细胞增加的数量以及Treg细胞减少的数量随着疾病进展呈现出正相关性的趋势[8-9]。
有研究发现，山柰酚可抑制DC细胞成熟与IL-6分泌，进而显著增加CD4+Foxp3+ Treg细胞的数量[10]。LIN等[11]采用山柰酚治疗胶原诱导性关节炎大鼠，与对照组比较，发现山柰酚可显著提高nTreg细胞中Foxp3、细胞毒性T淋巴細胞相关蛋白4和IL-10的mRNA水平，Treg细胞的免疫抑制能力因而提高，减轻了其病理症状。同时，通过使用山柰酚处理人nTreg细胞，还发现山柰酚可减少T效应细胞的增殖。这表明，山柰酚可双向调节Treg细胞的免疫抑制和Th细胞的促炎作用，进而起到免疫调节的作用。
1.2 抑制成纤维样滑膜细胞（FLS）异常增厚 RA最明显的病理表现是滑膜衬里层FLS明显增厚，由正常的1～3层增厚达到10层以上。造成
RA-FLS大量增殖的主要原因是其抗凋亡因素与促凋亡因素的作用程度不同，处于非平衡状态。IL-1β作为一种促生长因子，可促进RA-FLS增殖，抑制FLS的凋亡。FLS可分泌多种炎症因子和趋化因子，其中炎症因子有IL-6、IL-8（其同时也为趋化因子）等，趋化因子有生长相关致癌基因α等。首先，FLS的凋亡受到抑制。其次，RA-FLS通过特异性免疫活化T细胞，并使其增殖、分化、分泌细胞因子;同时，RA-FLS也通过自身分泌的炎症因子，进一步激活其他未活化的FLS。以上两个因素共同作用，导致滑膜炎的发生，细胞快速增殖，滑膜层增厚，不断侵蚀软骨与关节[12-15]。YOON等[16]在由IL-1β诱导的RA-FLS培养液中加入不同剂量的山柰酚（10，50，100，200 μmol·L-1）培养2 d，进行CCK-8分析，与对照组相比，发现山柰酚浓度越高，对IL-1β诱导的FLS增殖抑制越强。
1.3 抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的活化 RA患者的滑膜组织中细胞外调节蛋白激酶（ERK）、应激活化蛋白激酶（JNK）和p38 MAPK的信号通路水平明显升高，这3条信号通路作用各不相同，其中ERK通路控制细胞分裂增殖;JNK MAPK途径调节基质蛋白降解酶、蛋白水解酶的产生，进而调节细胞外基质的降解;而p38 MAPK通路可调节多种炎性因子的表达，控制细胞周期及凋亡。但MAPKs的这些信号通路并非相互独立，在RA滑膜细胞中有密切联系，相互影响，对细胞和软骨均有作用。信号通路的过度激活，会导致滑膜细胞增生增厚及各种骨组织的破坏，最终导致骨关节畸形[17]。PAN等[18]将RA-FLS与40 μmol·L-1山柰酚孵育24 h，然后使用10 ng·mL-1肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激10 min，
结果发现，ERK、JNK和p38的磷酸化减少，进而证明山柰酚可以抑制RA-FLS中MAPKs信号磷酸化。同时，PAN等[18]还进行了另一项研究，先使用40 μmol·L-1山柰酚预处理RA-FLS，然后用10 ng·mL-1TNF-α刺激12 h后，结果相对于对照组，基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13的mRNA上调被显著降低，说明山柰酚可能通过减少MMPs的表达，调节RA-FLS的迁移和侵袭，进一步防止RA的恶性进展。YOON等[16]研究发现，山柰酚通过抑制MAPKs途径进而抑制RA-FLS中环氧合酶-2的表达和前列腺素E2的产生。
1.4 延缓骨侵蚀病程 骨侵蚀即骨吸收，是RA的主要特征之一。出现骨侵蚀的原因是成骨细胞（OB）与破骨细胞（OC）相互作用不平衡，即OC骨吸收作用占主要地位，而OB的骨生成处于劣势地位[19]。OC是由骨髓造血细胞干细胞的单核/巨噬细胞融合分化而来的多核巨细胞，是体内唯一具有骨吸收能力的细胞。KIM等[20]研究发现，摩尔浓度超过50 μmol·L-1的山柰酚可以下调TNF受体相关因子（TRAF6）、活化T细胞核因子蛋白c-1（NFATc-1）和即刻早期因子c-Fos的表达，来抑制核转录因子-κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞分化成OC的过程，同时山柰酚还通过降解p62/SQSTM1进而抑制OC的分化。p62/SQSTM1蛋白可介导核转录因子-κB（NF-κB）的激活、NFATc-1和ERK的调控，进而促进OC的形成和活化[21]。
KIM等[22]通过MTT分析法确定在50 μmol·L-1及以上摩尔浓度时，山柰酚浓度的提高对MC3T3-E1细胞中的血清碱性磷酸酶（ALP）活性有显著抑制作用。用一定范围的不同摩尔浓度（1，2.5，5，10 μmol·L-1）的山柰酚处理培养的OB 24 h，最终通过免疫印迹实验等方法观察到OB活化因子RUNX-2、osterix、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的表达以剂量依赖性方式增加。其中5～10 μmol·L-1摩尔浓度，BMP-2表达水平显著提高，表明山柰酚诱导OB分化。
Wnt/β-catenin通路在RA中有重要作用，对骨损伤的修复有促进作用。Wnt/β-catenin通路可以调节OC和OB的平衡，促进OB发育与分化，同时抑制OC分化，进而促进骨修复[23]。SHARMA等[24]通过使用不同摩尔浓度（5，10，20，40 μmol·L-1）
的山柰酚处理SaOS-2和人原代OB 72 h，进行ALP活性测定以及Runx2和β-catnin的免疫组织化学，并且通过SaOS-2细胞转染含有雌激素反应元件报道基因和荧光素酶报告基因的3X-ERE-TATA-luc质粒载体，比较ICI 182、ICI 780（两种雌激素受体抑制剂）对山柰酚与17β-雌二醇（ERE-luc激活剂）作用的影响，研究发现山柰酚通过与SaOS-2细胞的雌激素受体结合，诱导其中ERE-luc活性的激活，主要通过雌激素信号通路激活下游的Wnt信号通路，进而促进OB的分化;同时，山柰酚也展现出通过雌激素信号通路提高人原代OB活性和其成骨标志物的mRNA水平，且较SaOS-2细胞更为显著。WANG等[25]研究发现，山柰酚通过上调MC3T3-E1细胞中miR-101的表达，从而激活Wnt/β-catenin通路，提高细胞的活力，促进增殖、迁移和分化。
1.5 抑制血管生成 血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）是血管內皮生长因子（VEGF）的一种受体，与VEGF的识别结合是刺激血管内皮细胞的主要机制。VEGFR-2即存在于血管和淋巴管，又主要作用于这两种器官。VEGF与VEGF-2结合可诱导血管内皮细胞增殖、迁移，增加血管的通透性[26]。较正常人而言，RA患者的血清中可以检测到VEGF和VEGF-2的表达量升高[27]。VEGF和VEGFR-2的过度表达是RA病理特征中血管生成的原因之一，在RA发展中起到重要作用。CHIN等[28]研究表明，山柰酚通过下调人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）中VEGFR-2的表达，抑制VEGF/VEGFR信号通路与下游相关蛋白（PI3K、p-Akt、p-mTOR）和信号通路（p-MEK和p-ERK1/2），共同起到抑制HUVEC增殖、迁移和侵入的作用，最终抑制血管的生成。
骨桥蛋白（OPN）是一种细胞外非胶原性基质蛋白，也参与组织修复、骨代谢等多个生物学过程，对RA的发生和病情加重有重要意义。OPN也是一种促炎因子，同时也具有诱导新血管形成的作用。αvβ3是一种细胞外基质黏附受体。OPN与整合素αvβ3相互作用后，激活NF-κB信号通路抑制内皮细胞凋亡，进而导致血管生成，进一步加重滑膜炎症，导致内皮细胞增殖，从而使更多血管生成，形成一种恶性循环[29-30]。RA患者OPN的mRNA表达主要在侵入软骨中的血管翳上。醛固酮可诱导产生OPN、IL-6和上调NF-κB的表达。摩尔浓度为106 mol·L-1的螺内酯可消除醛固酮的作用。XIAO等[31]通过使用不同摩尔浓度（1，3，10 μmol·L-1）的山柰酚或摩尔浓度为106 mol·L-1的螺内酯处理HUVEC 1 h，然后在山柰酚或螺内酯存在下暴露于摩尔浓度为106 mol·L-1的醛固酮下24 h，再进行OPN、αvβ3、IL-6蛋白表达测定，实验发现摩尔浓度为10 μmol·L-1的山柰酚对HUVEC的OPN、αvβ3的抑制与螺内酯的抑制效果近似。由此得出，山柰酚通过OPN-αvβ3整合素途径抑制HUVEC中NF-κB的活化，且较维生素C和LM609有更好的抑制作用。
2 结语与展望
RA是一种自身免疫性疾病，常累及诸多关节，并造成关节受损引发疼痛，且疼痛感与病情的严重程度呈正相关，严重影响患者及家庭的生活质量。当前，RA的患病率颇高，因此，寻找一种可改善RA病情，阻止其病理进程进一步发展的方法是其优选策略。山柰酚作为一种黄酮醇活性成分，在免疫调节，抑制滑膜异常增厚，调节相关信号通路，抑制骨侵蚀和血管生成等方面展现出治疗RA的潜力。但对于山柰酚抑制血管生成和抑制骨侵蚀的机制研究仍偏于细胞层次，动物实验及人体试验尚需要进行深入研究;其次，山柰酚发挥治疗RA的多途径、多靶点的内在调控及交互作用机制亦需要继续探索。
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收稿日期：2020-12-27;修回日期：2021-02-15
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